毛細(xì)管電泳技術(shù)在中藥分析中的應(yīng)用

中藥有效成分的分析有其特殊的復(fù)雜性,首先是中藥品種繁多,不同品種間活性成分的含量相差懸殊; 其次中藥有效成分受產(chǎn)地、栽培、生長環(huán)境和采收季節(jié)等多種因素的影響。

用于中藥成分分析的方法很多,其中HPLC 最常用。但用HPLC 進(jìn)行中藥成分分析常遇到一些問題,一是分析時間長、分離效率低,即使采用梯度洗脫技術(shù)也難以使某些成分完全分離; 二是由于中藥成分復(fù)雜,色譜柱容易被污染,而且污染后難于清洗,使柱的使用壽命縮短,且難以再生; 三是色譜柱上沉積的污染物,經(jīng)常以雜質(zhì)峰的形式出現(xiàn); 四是分析運(yùn)營成本高; 五是對于含極性成分較多的中藥,其“指紋”的特征不強(qiáng)。

高效毛細(xì)管電泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE)又稱毛細(xì)管電泳,是近十幾年來發(fā)展很快的高效分離分析技術(shù)。它以高壓電場為驅(qū)動力,毛細(xì)管為分離通道,依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù),具有分離效率高、速度快、靈敏度高、所需樣品少、溶劑消耗少、成本低且毛細(xì)管柱的費(fèi)用遠(yuǎn)低于高效液相的分析柱、前處理簡單、抗污染能力強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。下面簡要介紹一下高效毛細(xì)管電泳在中藥材鑒別中的應(yīng)用。1中藥及其炮制品鑒定中的應(yīng)用

許重遠(yuǎn)等[3]用酸性、堿性、中性3種提取液采取HPCE 技術(shù)對生藥狗脊、制狗脊及其混淆品黑狗脊進(jìn)行檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明其電泳圖譜存在顯著差異,并可利用酸性提取液的圖譜將生狗脊與制狗脊加以鑒別。2種子類藥材鑒定中的應(yīng)用

陳振德等[4]對國產(chǎn)榧屬植物種子蛋白進(jìn)行了HPCE分析,電泳圖譜區(qū)分了榧子、云南榧子、巴山榧子、香榧子、九龍山榧子、長葉榧子、日本榧子等,差異明顯,可作為中藥榧子的鑒別方法之一。陳振德等[5]還對酸棗仁及其混淆品同科植物滇棗仁(又稱理?xiàng)椚?和枳具子進(jìn)行HPCE 法鑒別。從應(yīng)用HPCE 對酸棗仁及其混淆品酸棗仁蛋白多肽檢測結(jié)果看,酸棗仁與其混淆品之間有明顯的差異,可有效地加以區(qū)分; 同時,本法需要的樣品少,操作簡單、重現(xiàn)性好,HPCE 作為酸棗仁的鑒別方法被證明是科學(xué)、可行的。胡平等[6]對中藥菟絲子(旋花科植物,Cuscuta chinensis Lam)及其混淆品金燈藤,南方菟絲子應(yīng)用HPCE 法進(jìn)行了生藥鑒別。實(shí)驗(yàn)表明,同屬不同種菟絲子的堿溶性和酸溶性蛋白在成分和含量上均有顯著差異。結(jié)果與運(yùn)用掃描電鏡和顯微鏡鑒別的結(jié)果一致,可有效鑒別菟絲子來源。婆羅子為多來源的生藥,性狀很難鑒別,張新等[7]采用HPCE-聚類分析法對不同產(chǎn)地不同原植物的生藥婆羅子進(jìn)行了有效鑒別。賈江濱等[8]對烏梅及其混淆品李子的蛋白多肽進(jìn)行了HPCE 法鑒別。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在酸性、堿性和中性蛋白提取液中烏梅和李子的HPCE圖譜都存在明顯差異。宋賢麗等[9]利用HPCE 法鑒別了6種決明屬的藥用植物種子,分別采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)和毛細(xì)管膠束電動色譜(MECC)兩種模式來進(jìn)行電泳,電壓分別選擇20、22、25、30kV,在200、214、220、235、245、500nm 處進(jìn)行檢測。不同來源鈍葉決明的電泳結(jié)果顯示,采集時間和地點(diǎn)的不同對峰數(shù)目和峰面積影響較小,因此,利用HPCE 鑒別決明類種子具有可行性。3根莖類藥材鑒定中的應(yīng)用

李玉琪等[10]利用HPCE 法以赤土茯苓苷為土茯苓的標(biāo)志性成分,選擇毛細(xì)管膠束電動色譜(MECC)分離模式對土茯苓(百合科菝葜屬植物光葉菝葜的干燥莖)及其6種混用品進(jìn)行了鑒別。分析樣品均為各藥材粉末的醇提液經(jīng)過0.45μm 濾膜過濾后直接進(jìn)樣,10min 即可完成,驗(yàn)證了高效毛血管電泳具有樣品處理簡單、操作簡便、分析快速等特點(diǎn)。該方法用于赤土茯苓苷的含量測定,也得到了準(zhǔn)確的結(jié)果,而且其檢測限很低(0.4μg/mL)。侯連兵等[11]對三七及其混淆品菊葉三七的蛋白多肽進(jìn)行了HPCE 法的鑒別,在酸性、堿性和中性提取液中三七及其混淆品都存在明顯差異。4花、葉及果實(shí)類藥材鑒定中的應(yīng)用

西紅花是名貴中藥以鳶尾科番紅花的柱頭入藥。紅花為菊科植物,頭狀花序入藥,有時充當(dāng)番紅花銷售。馬曉強(qiáng)等[12]對西紅花和紅花及偽品萱草和黃花菜應(yīng)用HPCE 法對其水溶性成分進(jìn)行了定性分析,西紅花、紅花、萱草和黃花菜四種“紅花”的毛細(xì)管電泳圖譜顯示了很大程度的不同。該方法速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好,可作為紅花類藥材的定性鑒別方法。謝立等[13]對龍眼肉及其混淆品荔枝肉的蛋白多肽應(yīng)用HPCE 法進(jìn)行了鑒別。陳志良等[14]對寧夏枸杞和枸杞的果實(shí)蛋白應(yīng)用HPCE 法進(jìn)行了鑒別,從檢測結(jié)果看,兩者在4.0min~12.0min 區(qū)間具有相同的主要特征吸收峰。同時,兩者在3種提取液中又有各自的特征吸收峰,兩者之間有明顯的差異,可有效地加以區(qū)分。王寅等[15]以HPCE 法對不同屬群大青葉藥材的理化特征差異進(jìn)行研究,結(jié)果表明異地栽培的不同屬群大青葉酸性提取部位的化學(xué)成分及含量有顯著差別,依據(jù)電泳圖譜中特征峰的遷移時間和峰面積,能有效鑒別不同屬群的大青葉藥材。5中藥有效成分測定中的應(yīng)用

HPCE 法可用于多種有效成分的分離和含量測定,如生物堿、黃酮類、苷類、有機(jī)酸類、醌類、酚類、香豆素類等。姜舜堯等[16]采用HPCE 以多潘立酮為內(nèi)標(biāo),運(yùn)行緩沖液為甲醇:20.6mol/L Tris 溶液(1:1),pH6.0,其中含10mmol/L 庚烷磺酸鈉,電壓20kV,檢測波長200nm,對夏天無藥材中的成分進(jìn)行分離研究,分析了原阿片堿和延胡索乙素的適宜分離條件,并測定了其中延胡索乙素的含量。趙霞等[17]用內(nèi)標(biāo)法分析了9種貝母藥材中浙貝乙素、西貝素、西貝苷等生物堿的含量。6中藥制劑生產(chǎn)質(zhì)量控制中的應(yīng)用

中藥制劑成分復(fù)雜,目前其質(zhì)量控制的方法多是測定其中一種或幾種指標(biāo)成分的含量,但種方法不能完全體現(xiàn)出中藥制劑的整體質(zhì)量,在尚不清楚全體化學(xué)成分的情況下,現(xiàn)代色譜、光譜、波譜、質(zhì)譜等儀器分析所得物質(zhì)群指紋圖譜展現(xiàn)了這種可能性。目前指紋圖譜已成為國際公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量最有效的手段。

許重遠(yuǎn)等[18]建立了甘草栓中甘草酸、甘草次酸的HPCE 法,為中藥甘草制劑的質(zhì)量控制提供新的檢測方法。尹茶等[19]建立了同時測定銀翹解毒片中綠原酸甘草酸和甘草次酸的HPCE 法,結(jié)果表明,HPCE 能在10min 內(nèi)完成銀翹解毒片中3種有效成分的測定,靈敏度高,適于中成藥中多種有效成分的同時測定。史國兵等[20]考察了四種不同柞蠶蛾提取物的九如天寶液與市售九如天寶液的HPCE 指紋圖譜的差異,認(rèn)為圖譜特征明顯、專屬性強(qiáng),為鑒別該藥物的真?zhèn)翁峁┝丝茖W(xué)依據(jù)。陳玉英等[21]采用HPCE 法測定了10批供試樣品的HPCE 指紋圖譜,建立相關(guān)的梔子藥材的指紋圖譜,并對該方法學(xué)進(jìn)行考察,結(jié)果符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》中有關(guān)規(guī)定,可作為控制含梔子等中藥制劑內(nèi)在質(zhì)量的方法。梁統(tǒng)等[22]用MECC 測定了補(bǔ)骨膠囊中淫羊藿苷的含量,并比較了由 SDS及脫氧膽酸鈉分別組成的電泳緩沖液對分離淫羊藿及其復(fù)方制劑中淫羊藿苷的影響,結(jié)論為由于雜質(zhì)對毛細(xì)管柱壽命無影響,分辨能力強(qiáng),能較好地把淫羊藿苷與干擾物分離,精密度高,有機(jī)溶劑消耗少,測定成本低,在中藥有效成分的分離檢測中顯示了較好前景。閆濱等[23]測定了克心痛滴丸中阿魏酸的含量,結(jié)果表明HPCE 法分離測定阿魏酸操作簡便,進(jìn)樣量小,分離完全,峰形正常。線性范圍較寬,重現(xiàn)性好,為中藥制劑中阿魏酸的質(zhì)量控制提供了新的實(shí)驗(yàn)手段。并從電泳圖譜發(fā)現(xiàn),克心痛滴丸中各組分均有良好的基線分離,提示對于其他組分定量分析的可能性。陳勇川等[24]在用HPCE 法測定刺五加注射液中槲皮素的含量中,考察了緩沖液的pH 值、濃度對樣品分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),緩沖液pH 為8.5時,運(yùn)行緩沖液為50mmol/L硼酸緩沖液,槲皮素有較好的分離效果,為刺五加注射液中有效化學(xué)成分的定量提供了一條新的途徑。陳勇川等[25]用HPCE 法測定了八珍丸和八珍益母丸中芍藥苷的含量,結(jié)果表明定量是準(zhǔn)確有效的,與HPLC 法測定結(jié)果基本一致。《中國藥典》(2000年版)一部中將HPLC 法作為八珍丸中芍藥苷定量的方法,要求理論塔板數(shù)不低于2000,而本實(shí)驗(yàn)中用HPCE 法的理論塔板數(shù)可達(dá)到100000以上,分離效率大大高于HPLC法。經(jīng)方法學(xué)考察,本法精密度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。于燕莉等[26]用HPCE 法測定了痹痛寧貼劑中東莨菪堿及烏頭堿的含量。由于生物堿類藥物的堿性強(qiáng),極性大,采用HPLC 分析時,往往被色譜柱吸附太強(qiáng),造成峰形不好,易拖尾。雖然可通過改善流動相介質(zhì)取得一定效果,但常用的離子對試劑對色譜柱污染極大。采用HPCE 法測定痹痛寧貼劑中2種生物堿的含量,具有分離效果好,可不經(jīng)富集直接檢測,操作簡便快速的優(yōu)點(diǎn),4min 即可得到電泳圖譜。郭丹等[27]在用HPCE 法測定生發(fā)靈酊中阿魏酸和大黃酸的含量時發(fā)現(xiàn):毛細(xì)管易沖洗再生,可保持高效,使各成分的分離較佳,并通過研究揭示了緩沖液濃度和pH 值對分離具有重要影響,選擇30mmol/L 硼砂(pH8.2)作為運(yùn)行緩沖液。7結(jié)語

高效毛細(xì)管電泳以其高效、快速、簡便且柱不易受污染的特點(diǎn)而優(yōu)于HPLC 法,在中藥有效成分的分離、定性定量、中藥材鑒別等方面應(yīng)用越來越廣泛,但目前仍存在重現(xiàn)性較差、線性范圍窄和靈敏度較低等缺陷。隨著商品儀器不斷改進(jìn)和完善,加上自動進(jìn)樣器的普遍使用,基本可以克服重現(xiàn)性差的缺陷,與常規(guī)HPLC 法接近; 靈敏度低可通過在柱預(yù)濃縮,如場放大堆積效應(yīng),或經(jīng)濃縮預(yù)處理,如固相萃取等技術(shù)加以改善。此外,HPCE 法可與其他進(jìn)樣技術(shù)如流動注射聯(lián)用,不但可提高測定精度,而且能完成連續(xù)自動進(jìn)樣及在線分析,方便大批量樣品的測定,或采用CE-MS、CE-NMR 及CE-MS-MS 的聯(lián)用技術(shù),充分利用HPCE的高分離效率和MS 或NMR 的高靈敏度與定性鑒定能力,快速完成眾多復(fù)雜成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定,大大提高和拓寬CE 的性能和應(yīng)用范圍,適用于中藥復(fù)雜化學(xué)成分的分離與測定。