《臨床生物化學(xué)》 一、核酸雜交技術(shù)

檢驗(yàn)方法建立的基本要素是特異性和靈敏度，在復(fù)雜的物體中，使無法感覺的特定物質(zhì)進(jìn)入人類的觀察范圍。核酸雜交檢測(cè)技術(shù)就是利用核酸堿基嚴(yán)格配對(duì)的特異性，核酸標(biāo)記物的靈敏度而建立的檢測(cè)核酸結(jié)構(gòu)與功能的方法。該法建立以來已有二十年，目前研究實(shí)驗(yàn)室用得多，臨床實(shí)驗(yàn)室用得較少，除成本高外，關(guān)鍵是操作復(fù)雜，重復(fù)性差，僅能半定量。成本高可隨經(jīng)濟(jì)發(fā)展而緩和，但其它缺點(diǎn)尚需努力克服。

雜交實(shí)驗(yàn)的探針應(yīng)具有特異性，對(duì)應(yīng)不同的雜交方法靶基因（被檢基因）應(yīng)有一定的純度與豐度。雜交反應(yīng)的開始是碰撞，探針濃度高則速率增加，一般32P標(biāo)記探記探針5-100ng/ml，非放射性探針25-1000ng/ml，原位雜交無論放射還是非放射物標(biāo)記，一般都需0.1-5.0μg/ml。當(dāng)探針過量時(shí)，雜交速率取決于探針長(zhǎng)度，如一個(gè)100ng/ml20個(gè)核苷酸的合成寡核苷酸探針與1-100pg 1kb長(zhǎng)的靶基因雜交，10分鐘能達(dá)到最大雜交率。而相同條件下2kb的克隆探針需160小時(shí)。主要原因是這里所指濃度是重量濃度而非摩爾濃度。長(zhǎng)探針因標(biāo)記量大，小的摩爾濃度已足以達(dá)到需要的檢測(cè)靈敏度。為了促進(jìn)長(zhǎng)探針（＞250個(gè)核苷酸）的雜交速率，加入雜交促進(jìn)劑是非常必要的。最常用的是硫酸葡聚糖，使用濃度為5％-10％，濃度過高會(huì)增加雜交液粘度。聚乙二醇也作為促進(jìn)劑，價(jià)廉且粘度低，但檢測(cè)本底太高。另外雜交的溫度、鹽濃度、甲酰胺濃度可調(diào)節(jié)雜交分子形成的穩(wěn)定性。理論選用DNA：DNA雜交溫度T＝Tm－25℃，此時(shí)雜交分子最易形成。但具體實(shí)驗(yàn)中影響Tm值的因素很多，一般雜交溫度低，形成的雜交分子較穩(wěn)定。RNA：DNA雜交分子的Tm大10-15℃，RNA：RNA雜交分子的Tm大20-25℃，使得雜交溫度提高，此時(shí)需調(diào)節(jié)甲酰胺濃度來調(diào)節(jié)雜交溫度。好的實(shí)驗(yàn)條件最終應(yīng)在實(shí)踐中摸索建立。

（一）斑點(diǎn)雜交

將少量核酸樣品點(diǎn)樣在硝酸纖維素濾膜上，80℃烘烤后可牢固地固定在膜上，再用探針進(jìn)行雜交。尼龍膜，特別是聚偏氟乙烯膜（PVDF）與DNA結(jié)合力更高，堅(jiān)韌、易操作。點(diǎn)樣可手工，也可用真空點(diǎn)樣品。檢測(cè)可用放射性探針自顯影或非放射性探針顯色。可用于DNA或RNA分析。下面以非放射性探針分析DNA為例，結(jié)果是顯色。

取硝酸纖維素膜和濾紙?jiān)?xSSC(NaCl 300mmol/L，檸檬酸鈉30mmol/L)，pH7.0浸15分鐘，平鋪濾紙?jiān)邳c(diǎn)樣抽濾器上，再鋪上硝酸纖維濾膜，真空抽氣使點(diǎn)樣器減壓，膜顯出凹面。點(diǎn)樣50μl（5-10μgDNA，可直接點(diǎn)血清樣品）于凹面，撤去真空，把膜晾干。取濾紙浸0.5mol/l NaOH，1.0mol/l NaCl，把膜平鋪于濾紙上20分鐘，變性。取濾紙二張分別浸在0.5mol/l Tris-Hcl pH7.5和1.0mol/l Tris-HCl，0.6mol/l NaCl pH7.5，分別依次把膜平鋪于濾紙上，各中和15分鐘，中和后膜的pH為7.2-7.5。于80℃，30-45分鐘烘干。（RNA分析點(diǎn)樣緩沖液系統(tǒng)不同，無需變性，中和，余大致相同）用塑料封口機(jī)把膜和2.5ml預(yù)雜交緩沖液封入塑料袋中，42℃，水浴30分鐘。

預(yù)雜交緩沖液：65℃6xSSC（原液：20xSSPE）5xDenhardt（50xDenhardt）0.5％SDS（10％SDS）100μg/ml變性鮭精DNA片段（1mg/ml）42℃增加50％甲酰胺（原液），配成20ml.

50xDenhardt：5g聚蔗糖（Ficoll，400型，Parmacia），5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（組份Ⅴ，Sigma）加水至500ml。過濾后－20℃保存。

探針2ml（50-100ng/2ml預(yù)雜交緩沖液）于100℃，10分鐘，馬上置冰浴5分鐘（變性）。加入袋封口。42℃水浴過夜。去雜交液（可回收）。以2xSSC，0.1％SDS15ml，50℃5分鐘洗二次。0.1SSC，0.1％SDS洗二次。封閉：另取袋封入膜和封閉液（蛋白質(zhì)50mg/ml，100mmol/l Tris-HCl(pH7.5)/150mmol/LNaCl）2.5ml，37℃，30分鐘。去封閉液（可回收）。100mmol/lTris-HCl(pH7.5)/150mmol/L NaCl ，15ml，5分鐘洗二次。親和反應(yīng)：酶標(biāo)抗體3ml（酶有堿性磷酸酶、過氧化物酶等，標(biāo)記物有抗地高辛、生物素等，現(xiàn)以地高辛標(biāo)堿性磷酸酶為例4μg/3ml 100mmol/L Tris-HCl，150mmol/l MgCl2，10mg/ml牛血清白蛋白），封入袋中37℃，30分鐘。100mmol/l Tris-Hcl，100mmol/l NaCl，50mmol/l MgCl2，pH9.5，10ml，1分鐘洗一次。取硝基四氮唑蘭（NBT）75mg/ml 70％二甲基甲酰胺25μl，4-溴-5-氯-3-吲哚磷酸50mg/ml二甲基甲酰胺20μl（底物）和100mmol/l Tris-HCl，100mmol/l NaCl，50mmol/l MgCl2，pH9.56ml混勻，37℃，避光反應(yīng)三小時(shí)，顯色。蒸餾水洗膜，晾干。觀察結(jié)果。

（二）Southern blot

1975年E.Southern發(fā)明了將DNA切開，電泳分離，再變性，印跡到硝酸纖維（Nc）濾膜上，用探針進(jìn)行雜交，檢測(cè)DNA的方法。自顯影或顯色用于DNA分析。以32P標(biāo)記放射性探針為例，放射自顯影觀察結(jié)果。（圖18-6）。

圖18-6　Southernblot體系

前述分離、純化的DNA樣品5-10μg/100μlTE，加限制性內(nèi)切酶3Unit/1μgDNA和內(nèi)切酶相應(yīng)緩沖液，在相應(yīng)溫度保溫1-3小時(shí)（不同的酶所用的緩沖液和溫度不同），乙醇沉淀，15-20μl TE溶解DNA斷片。前述電泳條件，與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品（Marker，Ladder）一起，3-4V/cm電泳（30V12-15小時(shí)）。在紫外光下觀察Marker充分分離，結(jié)束電泳。將膠放入0.5mol/l NaCl，0.5mol/L NaOH液體中30分鐘，使DNA變性。同時(shí)將膜用蒸餾水浸潤(rùn)，在0.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH液體的方盤皿上，放上濾紙兩頭浸在液體中，依次放上凝膠、膜、濾紙、一尺厚的吸水紙，壓力1kg的重物。轉(zhuǎn)移（印跡，blot）過夜。翌日，把膜放在0.5mol/l Tris-HCl，pH7.0-7.5，1mol/L NaCl液中，中和膜上堿性變性液15-30分鐘。戴上手套，用手指壓在膜上來回充分洗膜。室溫干燥一小時(shí)。用塑料封口機(jī)，把膜和預(yù)雜交緩沖液封在塑料口袋中，注意驅(qū)除袋內(nèi)汽泡。熱水浴過夜。探針變性后，加入袋中再封口。熱水浴過夜。

洗膜：2xSSPE，0.5％SDS，總體積200ml，室溫30分鐘。0.4％xSSPE，0.5％SDS，總體積200ml，60℃，30分鐘。將膜包入塑料袋，在暗室貼在X光底片上。－70℃，自顯影1-2天。沖片顯影，觀察結(jié)果（背景不清晰可重新洗膜再顯影）。

（三）Northern blot

用于RNA分析，電泳條件與轉(zhuǎn)膜方法與Southern blot不同外，RNA不必變性與中和，電泳時(shí)加電醛防止RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成。其它步驟相同。

為了防止RNase水解需分析的mRNA，盡可能將器皿在160-180℃干熱滅菌8小時(shí)以上，也可加0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）泡2小時(shí)，滅菌水淋洗干凈，100℃干烤15分鐘。不能干熱滅菌的試劑等，也可加1％DEPC處理12小時(shí)（但不能用于Tris）后，100℃。加熱15分鐘（或高壓滅菌15分鐘）以抑制、分解RNase。1.0g瓊脂糖，滅菌水80ml加熱溶解。加x50TAE2ml，EB25μl，滅菌水至1000ml。樣品緩沖液，x50TAE20μl，50％去離子甲酰胺500μl，甲醛180μl，混勻。約10-30μg/10μl純化的RNA樣品，加二倍（20μl）樣品緩沖液（可點(diǎn)樣一個(gè)凝膠孔lane）。60℃水浴15min，馬上置冰浴。加1/10電泳指示劑。點(diǎn)樣電泳，75-80V電泳4-5小時(shí)（指示劑泳動(dòng)7～8cm），結(jié)束電泳。電泳期間正負(fù)極緩沖液要不斷交換（可用蠕動(dòng)泵），以免pH改變。電泳結(jié)束，將凝膠放在紫外光下可觀察到人rRNA大亞基28S（5.1kb），小亞基18S(2.0kb)，記下大小亞基移動(dòng)距離（或拍照），可作為被測(cè)mRNA分子量分析的參照物。凝膠在50mmol/l NaOH中變性30分鐘（低濃度堿，此步可省）。膜在10xSSPE中浸20分鐘。用10xSSPE轉(zhuǎn)移過夜（同Southern blot）。80℃1-2小時(shí)干燥。用探針雜交后，顯影或顯色。

（四）原位雜交（insituhybridization）

在保持細(xì)胞形狀條件下，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)雜交，顯影或顯色。用于DNA或RNA分析。

細(xì)胞用離心涂片機(jī)涂片或組織切片置于載玻片上。4％多聚甲醛（PFA）/PBS固定（固定時(shí)間因標(biāo)本而異10-20分鐘，也可用含2％甲醛，0.05％戊二醛，2.5mmol/lCaCl2的0.1mol/L磷酸緩沖液pH7.3，500W微波爐中照射10-20秒，固定）。馬上用PBS洗標(biāo)本三次，2.5μg/ml蛋白酶K，37℃，5-20分鐘（因標(biāo)本和固定條件而定）處理。磷酸鹽類緩沖液（PBs NaCl 137mmol/l，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO48.1mmol/L，KH2PO41.5mmol/L）洗滌。4％PFA/PBS后固定，PBS洗一次，0.2％甘氨酸/PBS洗二次，每次15分鐘。預(yù)雜交：42℃，1小時(shí)。預(yù)雜交緩沖液：10％硫酸葡聚糖，10％Denhardt液，0.5％吐溫－20，250μg/ml鮭魚精子DNA，500μg/ml酵母tRNA。雜交：42℃，4小時(shí)。用2x雜交緩沖液（4xSSC，0.2mol/L磷酸鈉pH6.5，2xDenhardt）溶解已標(biāo)記探針，使其終濃度為0.1-1.0μg/ml。DNA檢測(cè)時(shí)把探針覆蓋在標(biāo)本上，置100℃5分鐘（變性）取出，雜交。mRNA檢測(cè)則先把探針置95℃水浴3分鐘，立即置冰水浴，再覆蓋標(biāo)本上進(jìn)行雜交。覆蓋標(biāo)本用液量100-200μl洗滌：2xSSC，50℃過夜。0.2xSSC，室溫1小時(shí)。載玻片浸在緩沖液中。顯色（試劑、方法參照斑點(diǎn)雜交的封閉-顯色部分）20分鐘-2小時(shí)，顯微鏡下觀察結(jié)果。