《臨床生物化學(xué)》 第三節(jié)　酶活性測定條件的選擇和限定

引言中已強(qiáng)調(diào)了僅在一定條件下酶反應(yīng)速度v才和酶量成正比例。一定條件是什么？這些條件之間有無主次關(guān)系？如何選擇合適的測定條件？這些都是實(shí)驗(yàn)室工作者在設(shè)計(jì)或選擇測酶活性濃度方法時(shí)必須面對的問題。

首先可從理論上探討在什么特定情況下的反應(yīng)速度才可能與酶量成正比例。酶的整個(gè)反應(yīng)過程可簡化如下：

式中Kp可看成為ES的解離常數(shù).Michaclis和Menten通過推導(dǎo)可得出下式方程式

此式中V為最大反應(yīng)速度，對一定濃度的酶而言為一常數(shù)。Km為實(shí)驗(yàn)室工作所熟系的米氏常數(shù)。上式也可改寫為：

Kp和Km雖為常數(shù)，但[S]為變量，因此在一般情況下不可能為常數(shù)，即v≠k[E]，從理論上很清楚說明反應(yīng)速度v和酶量E之間在絕大多數(shù)條件下只存正比，即v∝[E]。而非正比例關(guān)系。但在底物[S]濃度很大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過Km的特殊條件下Km值由于相對很小可忽略不計(jì)。此式可變?yōu)椋?/p>

由于底物[S]濃度很大，使酶飽和。ES已達(dá)極限，反應(yīng)速度不再增加，故此時(shí)反應(yīng)速度為最大反應(yīng)V。即從理論上說只有測定的是酶最大反應(yīng)V。此時(shí)反應(yīng)速度才和酶量E成正比例。也只有在此基礎(chǔ)上建立起來的測定方法才是可靠的、準(zhǔn)確的。

Kp是酶學(xué)中很重要的一個(gè)常數(shù)，即周轉(zhuǎn)數(shù)（Turnover number），從上式可得出。

其含義為每分鐘每分子酶轉(zhuǎn)換底物分子數(shù)。酶的Kp數(shù)值約在50-105min-1之間。碳酸酐酶是目前已知最高酶變率的酶（36×10-6min-1）。Kp的倒數(shù)代表每一酶催化循環(huán)的時(shí)間，以碳酸酐酶為例

1/Kp=lmin/136×106＝0.028×10－6min＝1.7μs

即每隔1.7μs，一分子酶就和一個(gè)底物結(jié)合，反應(yīng)一次。

國際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IFCC）和不少國家包括我國的一些學(xué)會(huì)建立了或正在建立測定酶活性濃度的推薦或參考方法。都毫無例外地提出測酶活性濃度方法所選擇的測定條件應(yīng)是酶反應(yīng)的“最適條件”以保證酶具有最大的催化活性。實(shí)質(zhì)上就是基于以上理論考慮，要測定酶的最大反應(yīng)速度V。

我國檢驗(yàn)學(xué)會(huì)文件中對最適條件是這樣提出：①選合適的底物、輔因子、活化劑、變構(gòu)劑的種類和濃度。②指示酶和輔助酶的種類和濃度。③反應(yīng)混合液的最適pH，緩沖液種類和濃度。④其它影響酶活性的因素，如去除各種抑制劑。并提出：在某些情況下，為了獲得更好的測定重復(fù)性或更大的臨床價(jià)值，可考慮對上述“最適條件”作適度的修改。