《臨床生物化學(xué)》 四、測(cè)定方法、標(biāo)本處理等對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

除了生理?xiàng)l件可引起酶測(cè)定值的變化外，還有其它一些非病理因素也會(huì)引起實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果的變化。

（一）酶測(cè)定方法

酶測(cè)定方法大致經(jīng)過(guò)三個(gè)歷史發(fā)展階段，50年代以前大都使用“固定時(shí)間法”，即讓酶與底物作用一段固定時(shí)間，一般為半小時(shí)左右，然后停止酶反應(yīng)，用光電比色測(cè)產(chǎn)物生成量或底物消耗量，從而計(jì)算出酶催化反應(yīng)的平均速度。再據(jù)此按各作者自己定義的“單位”向臨床報(bào)告測(cè)定結(jié)果。這些所報(bào)的單位往往在前面冠以作者的姓名命名，例如ALP根據(jù)不同測(cè)定方法就有金氏單位、鮑氏單位、國(guó)際單位等等。同一標(biāo)本不同單位結(jié)果從表面數(shù)值看可以差異很大。如ALP上列三種單位參考值分別為3-13金氏單位，0-3鮑氏單位，20-80國(guó)際單位。

50年代中期，國(guó)際臨床實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始采用“連續(xù)監(jiān)測(cè)法”，就是習(xí)慣上所稱(chēng)的“動(dòng)態(tài)法”。需要使用生化分析儀，可以測(cè)酶反應(yīng)的初速度，其結(jié)果遠(yuǎn)比“固定時(shí)間法”所測(cè)平均速度準(zhǔn)確，在高濃度標(biāo)本時(shí)尤為明顯。這樣同一疾病患者用兩種方法所測(cè)酶的結(jié)果并不一定平行一致。在疾病急性期，用新法測(cè)定結(jié)果增加倍數(shù)常明顯超過(guò)老法。例如在肝炎用賴(lài)氏法測(cè)ALT很少超過(guò)參考值上限的十倍。改用新法，在肝炎急性期可得到超過(guò)參考值上限數(shù)十倍乃至百倍以上的結(jié)果，由于后者結(jié)果和臨床病理變化相一致，結(jié)果準(zhǔn)確。目前在發(fā)達(dá)國(guó)家中，新法已幾乎取代了老法，我國(guó)也已開(kāi)始廣泛應(yīng)用新法。本書(shū)各論在討論各種疾病酶變化時(shí)，將主要根據(jù)新法加以敘述。用新法也就是“連續(xù)監(jiān)測(cè)法”所得結(jié)果，目前已基本統(tǒng)一使用1964年國(guó)際生化協(xié)會(huì)所規(guī)定的國(guó)際單位（IU）：即以每分鐘能催化1微摩爾底物的酶量為1個(gè)國(guó)際單位。如表示血清中酶濃度多以U/L表示之，即IL標(biāo)本（血清）中含的酶量，我國(guó)醫(yī)學(xué)界對(duì)此表示方法已經(jīng)熟悉習(xí)慣。我國(guó)現(xiàn)在規(guī)定SI制為計(jì)量的法定單位，SI制的酶單位為Katal，即每秒能催化1總分子底物的酶量為1個(gè)Katal，此單位不僅我國(guó)醫(yī)學(xué)家不熟悉，國(guó)際上應(yīng)用不多，如有可能可同時(shí)用兩種單位報(bào)告結(jié)果，或者注明轉(zhuǎn)換系數(shù)，即1U＝16.67μKatal。

但即使同使用連續(xù)監(jiān)測(cè)法，同用IU/L報(bào)告結(jié)果，不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果仍可出現(xiàn)較大差異。這是因?yàn)樯鲜龆ㄊ峭ㄟ^(guò)測(cè)酶催化速度來(lái)間接表示酶量高低，而酶催化的速度還受很多其它因素影響。首先是溫度，在國(guó)際單位定義中并未規(guī)定測(cè)定溫度，而反應(yīng)速度隨溫度升高而加速，一般說(shuō)每增加10℃，反應(yīng)速度將增加一倍。因此同一標(biāo)本、同一方法，在37℃所得結(jié)果將顯著高于30℃。雖然國(guó)際臨床化學(xué)協(xié)會(huì)（IFCC）推薦30℃為酶測(cè)定溫度，但臨床實(shí)驗(yàn)室由于實(shí)驗(yàn)工作方便等因素，愈來(lái)愈多使用37℃。因此本書(shū)各酶測(cè)定參考值將以37℃所測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，某些數(shù)據(jù)如在30℃測(cè)定將在結(jié)果后面用（30℃）表示。

除溫度外，測(cè)定時(shí)條件的不同也可能引起結(jié)果明顯差異。最突出例子是ALP測(cè)定，用二乙醇胺為緩沖液測(cè)出ALP結(jié)果比用氨基甲基丙烷為緩沖液的高2-3倍。又如在ALT測(cè)定時(shí)，如在底物中加入磷酸吡哆醛比不加者結(jié)果可增高20％-100％。正因?yàn)槿绱?，為防止臨床醫(yī)生產(chǎn)生錯(cuò)覺(jué)，認(rèn)為IU/L結(jié)果在國(guó)際上應(yīng)一致。目前實(shí)驗(yàn)室常以U/L，而不以IU/L向臨床報(bào)告。

總之，臨床醫(yī)師在分析酶測(cè)定結(jié)果（U/L）時(shí)應(yīng)以給報(bào)告實(shí)驗(yàn)室的參考值為準(zhǔn)，盲目套用文獻(xiàn)結(jié)果或與其它實(shí)驗(yàn)室結(jié)果相比較，有可能得到不恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)論。

前面已提到從70年代以來(lái)，隨免疫技術(shù)發(fā)展，出現(xiàn)利用酶的抗原性，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)直接測(cè)定酶的質(zhì)量。測(cè)定結(jié)果不是以U/L報(bào)告而是直接用ng/ml，μg/L等報(bào)告酶蛋白含量高低。如臨床醫(yī)師看到這樣的報(bào)告，就可知道此時(shí)使用了最新的免疫學(xué)方法測(cè)酶，其臨床意義有可能與前兩種方法結(jié)果有差異。例如國(guó)外公認(rèn)，同樣測(cè)CK-MB，用免疫學(xué)方法所測(cè)結(jié)果診斷價(jià)值最高，此問(wèn)題將在后專(zhuān)門(mén)敘述。

（二）標(biāo)本的采集、處理與貯存

在實(shí)驗(yàn)室測(cè)定酶之前，標(biāo)本還要經(jīng)過(guò)采集、分離血清和貯存等一系列處理過(guò)程。而酶在血中是處于一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，血液離開(kāi)體內(nèi)后，還會(huì)有一定變化。因此在其中任何一個(gè)階段處理不當(dāng)，都有可能引起測(cè)定值變化。

采取血液標(biāo)本時(shí)最容易引起實(shí)驗(yàn)室誤差的是抽血不當(dāng)，或者實(shí)驗(yàn)室急于分離血清，因此體外溶血。由于大部分酶在細(xì)胞內(nèi)外濃度差異明顯，少量血細(xì)胞的破壞就有可能引起血清中酶明顯升高。最明顯例子是LD，紅細(xì)胞中LD約為血清的100倍，這樣，只要有輕度溶血，如1/100紅細(xì)胞破壞，就足以使血清中LD升高一倍，常使原為正常的血清LD值超過(guò)參考值上限。其它如CK，雖然紅細(xì)胞中無(wú)CK，但含有豐富腺苷酸激酶（AK），進(jìn)入血清能使某些用“連續(xù)監(jiān)測(cè)法”測(cè)定CK的值假性升高，紅細(xì)胞中酶的干擾，不僅表現(xiàn)在溶血影響上，采血后如不及時(shí)將血清和血凝塊分離，血細(xì)胞中酶同樣可以透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入血清，所以采血后1-2小時(shí)實(shí)驗(yàn)室必須及時(shí)離心，分離血清。

除非測(cè)定與凝血或纖溶有關(guān)的酶，一般都不采用血漿而采用血清作為測(cè)定標(biāo)本。大多數(shù)抗凝劑都在一定程度上影響酶活性，例如EDTA為金屬離子螯合劑，在去除Ca2+同時(shí)也去除其中Mg2+、Mn2+等離子，Mg2+是ALP、CK和5′-核苷酸酶（5′-NA）作用的激活劑，其它如草酸鹽、枸櫞酸鹽乃至肝素都對(duì)一些酶有一定程度抑制。有必要時(shí)，可考慮使用肝素為抗凝劑，在常用抗凝劑中它對(duì)酶影響最小的。

酶蛋白不穩(wěn)定，易失活，ACP是最明顯的一個(gè)例子。此酶在中性或堿性環(huán)境中極不穩(wěn)定，血液在37℃放置1小時(shí)，ACP活性可下降50％。大部分酶在低溫中比較穩(wěn)定，分離血清如不能及時(shí)測(cè)定，應(yīng)放冰箱保存，表（7-3）是常用酶在不同溫度情況下的穩(wěn)定性。

從表7-3可看出－25℃將血清凍結(jié)并沒(méi)有太大優(yōu)點(diǎn)，相反有些酶如ALD、ALT在融凍時(shí)被破壞。有文獻(xiàn)報(bào)道用液氧在－195℃貯存血清，常用酶如ALT、AST、ALP、CK、LD、GGT和AMY，在10個(gè)月活性變化不大。個(gè)別酶如LD在低溫反而不如室溫穩(wěn)定，即所謂的“冷變性”。

表7-3　酶在不同溫度儲(chǔ)存的穩(wěn)定性（活性變化小于10％）

酶室溫（25℃）冰箱（0-4℃）冰凍（－25℃）ALD2天2天不穩(wěn)定※ALT2天5天不穩(wěn)定※AST3天1周1月ALP2-3天2-3天1月GGT2天1周1月CHE1周1周1周LAP1周1周1周CK1周1周1周LD1周1-3天1-3天ICD1天2天1天AMY1月7月2月LPS1周3周3周ACP4小時(shí)￥3天§3天§亞鐵氧化酶I1天2周2周（銅氧化酶）

※酶不耐融化；

￥　標(biāo)本未酸化；

§標(biāo)本加枸櫞酸到pH5