《實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸》 三、地高辛配基隨機(jī)標(biāo)記DNA探針?lè)?/h1>

（一）概述

基因診斷是以核酸分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)，在核酸水平檢測(cè)人類(lèi)遺傳性疾病的基因缺陷和一些傳染病病原體的方法。其基本過(guò)程是：制備DNA探針，標(biāo)記探針，檢測(cè)樣本。開(kāi)展這項(xiàng)工作的關(guān)鍵是要得到高靈敏度、高特異性的探針。以往人們是用放射性同位素來(lái)標(biāo)記探針DNA。近年來(lái)，非同位素標(biāo)記方法發(fā)展很快，已有取代同位素標(biāo)記法的趨勢(shì)。地高辛配基隨機(jī)標(biāo)記DNA探針?lè)?，是較為成功的一種非同位素標(biāo)記方法。其原理是：用化學(xué)方法把類(lèi)固醇類(lèi)半抗原地高辛分子連接在dUTP上（Dig-dUTP）。用隨機(jī)引物及DNA多聚酶，以探針DNA為模板，合成互補(bǔ)DNA，化學(xué)修飾過(guò)的dUTP同時(shí)摻入到標(biāo)記的DNA探針中。雜交后用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛單抗與標(biāo)記探針DNA中的Dig-dUTP結(jié)合，加入顯色底物，在堿性磷酸酶作用下，轉(zhuǎn)變成深棕色或藍(lán)色的化合物。

1．標(biāo)記　本試劑盒采用隨機(jī)引物標(biāo)記方法，可標(biāo)記少至10ng，多至3μg的DNA。能在新合成的DNA鏈每20～25個(gè)核苷酸，摻入一個(gè)Dig-dUTP，反應(yīng)時(shí)間約為1h。

2．雜交　按標(biāo)準(zhǔn)雜交方法進(jìn)行?？梢圆捎媚猃埬せ蛳跛崂w維素膜。用過(guò)的雜交液可凍存于-20℃，重復(fù)使用。

3．免疫學(xué)檢測(cè)　封阻后，檢測(cè)反應(yīng)的第一步，抗體結(jié)合物與標(biāo)記DNA結(jié)合，出現(xiàn)雜交的半抗原-標(biāo)記DNA，顯色反應(yīng)起始是在堿性pH條件下加入無(wú)色的顯色劑X-磷酸鹽和NBT，在幾分鐘內(nèi)便開(kāi)始出現(xiàn)藍(lán)色，顯色反應(yīng)的過(guò)程持續(xù)3d。典型的例子是在24h后終止顯色反應(yīng)。用二甲基甲酰胺洗掉尼龍膜上的顏色后，尼龍膜可重新用于雜交。

4．應(yīng)用　地高辛配基標(biāo)記DNA探針及檢測(cè)試劑盒，能檢測(cè)0.1pg的同源DNA，能檢測(cè)1μg哺乳動(dòng)物DAN中的單拷貝基因，與放射性標(biāo)記系統(tǒng)比較，此試劑盒能快速得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果（從DNA的標(biāo)記和雜交至見(jiàn)到檢測(cè)結(jié)果24h內(nèi)能完成），而且消除了放射性的不安全問(wèn)題。這試劑的靈敏度與特異性使它適用于所有的雜交技術(shù)（包括DNA-印跡轉(zhuǎn)移，菌落雜交，噬菌斑雜交及原位雜交）以替代同位素標(biāo)記和放射自顯影術(shù)。

（二）試劑盒成份

1．無(wú)標(biāo)記對(duì)照DNA1　此管內(nèi)有20μl pBR328 DNA100μg/ml,pBR328分別用BamHⅠ,BglⅠtHinfⅠ消化，它們的混合比例為2：3：3，共有16個(gè)Pbr328片段，這些片段的大小分別為：4907，2176，1766，1230，1033，653，517，453，298，234，234，220和154×2bp。

2．無(wú)標(biāo)記對(duì)照DNA2　此管內(nèi)有20μl pBR328 DNA200μg/ml，已用EcoRⅠ線性化。

3．DNA稀釋緩沖液　有兩管，每管1ml[成分為：Tris-HCl(10mmol/L),EDTA(1mmol/L),pH8.0(20℃)]內(nèi)含鮭魚(yú)精DNA（50μg/ml）。

4．標(biāo)記對(duì)照DNA　此管內(nèi)有50μl線性化pBR328DNA，按標(biāo)記方法已標(biāo)記有地高辛配基dUTP,含20μg模板DNA，每毫升含5μg合成的標(biāo)記DNA。

5．六聚核苷酸混合物

6．標(biāo)記用混合底物　此管內(nèi)有50μl10倍濃度的dNTP標(biāo)記用混合底物，含dATP（1mmol/L）dCTP(1mmol/L),dGTP(1mmol/L),dTTP(0.65mmol/L)和Dig-dUTP(0.35mmol/L),pH6.5(20℃)。

7．DNA聚合酶Ⅰ大片段（標(biāo)記級(jí)）　此管內(nèi)有25μl DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow），2U/μl。

8．（Dig）AP結(jié)合物　此管內(nèi)有200μl多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段，結(jié)合有堿性磷酸酶750U/ml。

9．NBT　有兩管，每管1.25ml，是溶于70%（V/V）二甲基甲酰胺的硝基藍(lán)四唑鹽溶液（75mg/ml）。

10．X-磷酸鹽　有兩管，每管0.9ml，是溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽的甲苯胺溶液（50mg/ml）。

11．封阻試劑　有兩瓶，每瓶有50g粉劑。

（三）需配制的溶液

EDTA（0.2mol/L）,pH8.0(20℃);LiCl(4mol/L);70%(V/V)乙醇；Tris-HCl(10mmol/L);ED－TA(1mmol/L),pH8.0(20℃);10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸鈉鹽；10%（V/V）SDS；20×SSC：3mol/l NaCl;0.3mol/L檸檬酸三鈉；pH7.0Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L);pH7.5Tris–HCl(100mmol/L);NaCl(100mmol/L);MgCl2(50mmol/L)pH9.5(20℃)。

（四）操作方法

1．標(biāo)記DNA探針　每次標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)可標(biāo)記10ng至3μg線性的DNA，也可標(biāo)記更大量的DNA，但所有的成分和體積要相應(yīng)增加。

（1）DNA探針熱變性，煮沸10min，迅速冷卻于冰/乙醇中5min以上，待用。

（2）取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上，加下列及試劑：

新鮮變性的DNA 1-3μg

六聚核苷酸混合物 2μl（管5）

dNTP標(biāo)記用混合底物 　2μl（管6）

加無(wú)菌重蒸水至　 19μl

DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）　1μl（管7）

（3）在37℃保溫至少60min，可到20h。

（4）煮沸5min，終止反應(yīng)。

（5）15000rpm離心30s，置于冰上待用。

2．預(yù)雜交　按100cm2膜用20～40ml預(yù)雜交溶液，預(yù)雜交時(shí)使溶液處于流動(dòng)狀態(tài)。

預(yù)雜交液組成：5×SSC

0.5%（W/V）封阻試劑（管11）

0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉

0.02%（W/V）SDS

膜放入塑料袋，灌入預(yù)雜交液，排除氣體后密封，在65℃預(yù)雜交過(guò)夜。

3．雜交　按100cm2膜用2.5ml雜交液，雜交時(shí)偶爾搖動(dòng)雜交袋，使里面的溶液重新分配。

雜交液組成： 50%甲酰胺（V/V）

5%（W/V）封阻試劑

5×SSC

0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉

0．02%(W/V)SDS

新變性標(biāo)記DNA（150ng/ml）

雜交液取代預(yù)雜交液，替換間膜不能干，成功地替換應(yīng)是膜與塑料袋間形成一層雜交液膜。于42℃雜交過(guò)夜（16～20h）。

4．洗膜按100cm2膜用250ml洗膜液計(jì)算。

（1）在室溫下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。

（2）在65℃條件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。

（3）在室溫下用2×SSC溶液漂洗1次。

5．免疫測(cè)定

（1）配制溶液

緩沖液1：Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃）

緩沖液2：0.5%(W/V)封阻試劑(管11),配制于緩沖液1中(封阻試劑不會(huì)快速溶解,因此應(yīng)預(yù)早1h前配制此溶液,將試劑溶于50～70℃,此溶液保持混濁)。

緩沖液3：Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。

緩沖液4：Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)

顯色溶液：新鮮配制，在10ml緩沖液3中，加45μlNBT溶液（管9）和35μlX-磷酸鹽緩沖液（管10）。

2． 顯色過(guò)程

A．膜在緩沖液1中短暫洗滌（1min）。

B．在100ml緩沖2中保溫30min。

C．再用緩沖液1短暫洗滌。

D.用緩沖液1稀釋的抗體結(jié)合物(管8)至150U/L(1:5000);稀釋后的抗體結(jié)合物在4℃只能穩(wěn)定12h。

E.膜在20ml稀釋的抗體結(jié)合物溶液中保溫30min。

F.用100ml緩沖液1洗膜,以除去未結(jié)合的抗體結(jié)合物,15min,2次。

G.膜在緩沖液3中平衡2min。

H.在黑暗條件下,膜與10ml顯色溶液放入塑料袋內(nèi)密封或放入合適的盒子內(nèi),幾分鐘內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)顏色,一般顯色反應(yīng)在1天后全部完成。當(dāng)顏色顯影時(shí)，不可振蕩或攪拌。

I．當(dāng)要求的點(diǎn)或帶已被檢測(cè)時(shí)，可用50ml緩沖液4洗膜5min終止反應(yīng)。

J．?dāng)z相。

說(shuō)明：上述各反應(yīng)均在室溫下進(jìn)行，除了顯色反應(yīng)外，均需振蕩或攪拌。

（五）排除實(shí)驗(yàn)中問(wèn)題的方法

1．DNA不能有效地被標(biāo)記時(shí)考慮

（1）用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新純化DNA。

（2）標(biāo)記反應(yīng)的保溫時(shí)間延長(zhǎng)（增至20h）。

（3）DNA變性或許不完全，這時(shí)對(duì)大片段DNA特別重要。

2．不能達(dá)到預(yù)期的靈敏度時(shí)考慮

（1）DNA標(biāo)記率。

（2）增加標(biāo)記DNA的濃度或增加雜交時(shí)間。

（3）顯色反應(yīng)的時(shí)間可延長(zhǎng)至3d。

3．若顯色時(shí)背景過(guò)深，可采取

（1）在雜交溶液中減少標(biāo)記DNA量。

（2）增加雜交溶液的體積，使膜隨意漂浮在溶液中。

（3）某些類(lèi)型的尼龍膜可能產(chǎn)生深色背景，因此可采用其它類(lèi)型的尼龍膜或改用硝酸纖維素膜。

（4）在雜交和檢測(cè)過(guò)程中增加封阻試劑的濃度。