《臨床生物化學》 二、方法建立時的條件選擇

在方法建立的原理確定后，尚需根據(jù)其原理來選擇合適的條件，以保證所建的方法可靠。下面以亮度法為例介紹其條件選擇的主要環(huán)節(jié)。顏色反應是亮度分析的基礎，因此，用作亮度測定的顏色反應至少要具備以下幾條：反應有較高的特異性，從而干擾?。环磻a(chǎn)生的有色物質(zhì)吸光系數(shù)要大，大者靈敏度高；有色產(chǎn)物的離解度要小，小則穩(wěn)定；此外，還要求有色產(chǎn)物有恒定的組成成分，使產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定。由于影響顏色反應的因素很多，如溫度、pH、試劑濃度、反應的時間等等。這些因素在建立新方法時都要逐項試驗，確定最佳實驗條件。

（一）選擇合適的吸收光譜

實際上就是測定顏色反應產(chǎn)生的光吸收曲線。方法是在整個可見光區(qū)（400-700nm）以10nm（在接近最大吸收波長范圍還應再細分）間隔。分為十幾個點測定其在不同波長時的吸光度，然后以吸光度為縱坐標，波長為橫坐標繪成光吸收曲線。在條件許可的情況下，應采用雙光束分光光度計在可見光區(qū)進行波長掃描，結(jié)果較為可靠。同時，還應以同法分別測定其空白液和標準物顏色產(chǎn)物的吸收曲線。測定光吸收曲線的目的是找出最大吸收波長，作為光度法波長選擇的依據(jù)。因為在最大吸收波長測定，可獲得最大靈敏度，且能更符合比耳定律。然而在實際使用中，不能單純考慮靈敏度高，還要考慮在測定濃度范圍能否符合比耳定律，并能在光度計準確區(qū)域內(nèi)（吸光度0.2-0.85之間）讀出讀數(shù)。有時由于測定的最大吸收波長并不是所要測定物質(zhì)的特性吸收波長，即同時存在具有相似最大吸收的干擾物質(zhì)，為了保證實驗的特異性，常改用特有而非最大吸收波長進行測定。例如用磷鉬酸測定血糖，選用波長420nm，溶液對此波長的吸收比其它波長光線的吸收都低，其目的是使參考值有一個較低的吸收，這樣可允許在相同情況下對高出參考值的血糖也能得到準確的讀數(shù)。因為在這項測定中，高血糖是常見的變化方向。

（二）測定方法適用的濃度范圍

根據(jù)光吸收定律，溶液的吸光度應與溶液的濃度成正比。但由于有色物質(zhì)的電離、水解、締合等原因當溶液稀釋或增濃時，有色物質(zhì)顏色的深淺并不按比例降低或增高，因而也就不符合光吸收定律。測定方法適用的濃度范圍是指分析的濃度范圍在直線線性段，濃度與吸光度之比為一常數(shù)，此時直線上任何一點的斜率tanθ相等，即：

tanθ＝A1/C1＝A2/C2＝A3/C3＝……＝An/Cn＝K

此處K即為校正常數(shù)，可用于結(jié)果計算。

通常稀溶液都是符合比耳定律的，但在濃度過高和過低時往往都不呈直線，說明低濃度部分亦有儀器的靈敏度和方法的檢測能力限制，所以，具體的測定就宜選擇在直線段濃度范圍內(nèi)進行。以此還可用于確定標本的用量，使具有臨床意義的標本測定結(jié)果都落在直線范圍內(nèi)。

（三）觀察影響顏色反應的因素

影響顏色反應的主要因素有：溶液pH的影響、雜質(zhì)的影響、反應的溫度和時間、以及顏色的穩(wěn)定性等。這些都是光度法測定誤差的主要來源。都需要通過實驗來觀察并控制在一個適宜的范圍內(nèi)。從而保證方法的準確性和精密性。

⒈溶液pH的影響有些溶液的顏色對pH值的改變非常靈敏。例如白蛋白在pH4左右可與溴甲酚綠結(jié)合后由黃色變成綠色，綠色的深淺與白蛋白濃度成正比，但是溴甲酚綠本身是一種pH指示劑，當pH5.4時即由黃色轉(zhuǎn)變成綠色，在pH3.8時又由綠色變?yōu)辄S色。在白蛋白與溴甲酚綠結(jié)合顏色反應中，如pH控制不好就很容易出現(xiàn)誤差，又如每種酶都有各自的最適pH，酶促反應中，只有在其最適pH時才能發(fā)揮充分的催化活性。因此，在建立方法時可在不同pH值條件下（其它條件不變）令其反應，以觀察顏色反應的吸光度變化，從而選擇合適的pH值范圍來保證顏色反應，以求較高的靈敏度和較好的線性。有時還需用相應的pH緩沖液來維持反應的pH，以利顏色反應的正常進行。

⒉雜質(zhì)的影響由于臨床生化標本中除含待測物質(zhì)外，還含有許多非測定物質(zhì)，成分十分復雜，它們有的可與有色產(chǎn)物作用，使產(chǎn)生的顏色逐漸退去，有的與待測物質(zhì)相類似，也能緩慢地與顯色試劑生成有色化合物或沉淀，有的本身是有色的等，都會影響被測物溶液的顏色。試驗方法是將各種可疑物質(zhì)的純?nèi)芤鹤鳂吮締为氝M行測定，如產(chǎn)生顏色反應，這說明該方法的特異性不高。如果將待測物質(zhì)混入可疑物質(zhì)作標本測定，改變了被測物質(zhì)與試劑間的反應，這是干擾（具體方法見第三節(jié)）。為此就需要進一步改進方法，或設立標本空白，或?qū)吮咀鬟m當處理，除去干擾物，或加入合適的干擾物掩蔽劑等，以提高方法的特異性。

⒊反應的溫度和時間有些有色物質(zhì)能迅速反應生成，另一些有色物質(zhì)須經(jīng)過相當長時間后反應才能完全。提高反應的溫度可以加速化學反應，縮短反應的時間。因此，如果在不恰當?shù)臏囟群蜁r間內(nèi)進行比色，將會造成相當大的誤差。這可以在不同的溫度下（如設定25℃，30℃，37℃）令其反應，通過檢測吸光度來觀察各自反應終點時間（一般達到反應終點，隨后測定的吸光度不再變化），以選定適宜臨床應用的反應最佳溫度和時間。

⒋穩(wěn)定性試驗待測物質(zhì)經(jīng)顯色反應產(chǎn)生的有色物穩(wěn)定與否，關(guān)系到測定結(jié)果的可靠性。某些有色物質(zhì)雖然生成很快，但卻不太穩(wěn)定，放置后色澤會逐步消退或起變化，有些干擾物雖不能與被測物質(zhì)同時發(fā)生顏色反應，但當放置一段時間后也能緩慢地與試劑顯色，使溶液顏色加深。因此，在方法建立的同時作穩(wěn)定性試驗很有必要。試驗的方法是用被測標本、標準溶液、空白溶液按方法要求進行顯色反應后，即刻及室溫放置不同時間，分別測定其吸光度，根據(jù)其吸光度的變化確定方法穩(wěn)定的時間范圍。一般要求有色溶液能穩(wěn)定二小時以上就能滿足臨床應用的需要。必要時還要加以注明。