《臨床生物化學》 三、基因庫的建立

建立基因庫的目的是為了便于目的基因的保存、擴增和純化?；驇焓抢霉ぞ呙?，通過基因重組技術和轉化、篩選而建立，也是基因克隆的過程。實際上是利用低等生物如細菌、病毒、噬菌體等生長快，繁殖力強的特點，而作為一種核酸擴增篩選的載體，把人類等高等生物的基因或其片段用工具酶插入，重組于其中，經(jīng)篩選，克隆得到目的基因與載體重組的重組基因，成為便于保存，取用方便的基因庫?；驇旖涣魇茄芯渴抑g交流目的基因的常用方式。

（一）基因重組

基因重組方案很多，簡單的可用同一種限制性內切酶分別在載體和目的基因切出相對應的切口，便于連接。也可用末端連接酶合成連接器（圖18-3）。近年，Okayama方案為實驗室普遍采用，該方法可得到全長的cDNA。

（二）轉化

轉化目的是把有復制能力，但在細胞外無復制活性的目的基因-載體重組體裝入細胞（大腸埃希菌），使目的基因隨載體在細胞內復制、擴增。實驗步驟介紹如下：

圖18-3　基因重組方案之一

⒈大腸埃希菌的處理（增加細胞膜通透性，便于基因進入細胞）大腸埃希菌（E.Coli cells）接種于Lb agar培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)一晚。挑選3~5個大菌落，接種于50ml LB培養(yǎng)基，37℃，振搖培養(yǎng)一晚后，在A550測定，要求細菌繁殖一定量（一般為細菌對數(shù)生長期），野生型（rec＋，5x107cells/ml）為0.2-0.3，缺陷型（rec-，5x107cells/ml）為0.5-0.6。離心棄去上清液，用20ml，50mmol/L，CaCl2懸浮菌體。冰浴20分鐘，低溫離心。棄上清液，用2.5ml冰50mmol/l CaCl2懸浮。4℃可保存48小時，用于轉化，稱competent cells。

⒉質粒（如經(jīng)基因重組建立的重組質粒，基因庫等）的轉化 將competent cells（以美國BRL公司DH10B菌株為例）置冰水浴。同時將Falcon2059（傳熱系數(shù)穩(wěn)定）塑料試管置冰水浴。取100μl菌液（DH10B）于2059試管中，加10倍稀釋的巰基乙醇1μl，冰浴輕搖2分鐘，放置10分鐘。取0.1-50ng質粒加入試管，輕輕搖勻，冰浴30分鐘。此間備好42℃水浴。并將SOC培養(yǎng)基置42℃?zhèn)溆?。將試管置?2℃，輕搖45秒鐘，馬上置冰浴2分鐘。使competent cells熱脹冷縮，把質粒導入菌體。加42℃SOC培養(yǎng)基0.9ml于試管，37℃培養(yǎng)1小時。1000rpm離心10分鐘，棄上清液，用200μlSOC培養(yǎng)基懸浮菌體。接種于LB-氨芐青霉素（100U/ml）培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)一晚。已轉化的菌體可形成菌落（因質粒上有抗氨芐青霉素基因）。在了解目的基因或其產(chǎn)物的基礎上對菌落進行鑒定。并在LB培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)。基因庫的建立、轉化、篩選、擴增、純化的過程就是基因克隆的過程。

LB培養(yǎng)基（1L）：10g蛋白胨，5g酵母膏，10gNaCl，高壓滅菌，pH7.5。

SOB培養(yǎng)基（1L）：20g蛋白胨，5g酵母膏，0.5gNaCl，高壓滅菌。另外準備2mol/L鎂溶液（1mol/L氯化鎂與1mol/L硫酸鎂等量混勻，過濾滅菌），臨用前加1ml于100ml培養(yǎng)基。

SOC培養(yǎng)基（100ml）：臨用前加入1ml過濾滅菌的2mol/L葡萄糖。