《臨床生物化學(xué)》 三、連續(xù)監(jiān)測法測酶活性濃度

連續(xù)監(jiān)測法具有眾多的優(yōu)點(diǎn)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，自動(dòng)生化儀的使用，正在逐步取代“固定時(shí)間法”，發(fā)達(dá)國家從50年代到70年代末用了約20余年的時(shí)間，我國從80年代初開始使用連續(xù)監(jiān)測法，雖然發(fā)展很快，但至少仍有不少地區(qū)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室仍使用老的方法，就是已使用新法的實(shí)驗(yàn)室，也不一定掌握得很好，本節(jié)將比較詳細(xì)地從分類，酶偶聯(lián)反應(yīng)，測定注意事項(xiàng)等方面對(duì)連續(xù)監(jiān)測法加以介紹。

（一）連續(xù)監(jiān)測法種類

⒈直接連續(xù)監(jiān)測法這類方法是使用各種分析手段，如分光亮度法、熒光法、pH計(jì)、旋光計(jì)、電導(dǎo)儀等等，在不停止酶反應(yīng)條件下直接測反應(yīng)體系中底物或產(chǎn)物的變化，從而計(jì)算出酶活性濃度，其中尤以分光光度法應(yīng)用最多，應(yīng)用最廣的有NAD(P)H反應(yīng)系統(tǒng)，可以測定大部分的脫氫酶，還有的是所謂“色素原”底物，其本身為無色或微黃色，在酶作用下生成有色化合物，適用于測定水解酶和一些轉(zhuǎn)移酶。

⒉間接連續(xù)監(jiān)測法直接法試劑簡單，操作方便，可惜的是只有當(dāng)?shù)孜锱c產(chǎn)物之間，在光學(xué)性質(zhì)或其它理化性質(zhì)有顯著差異時(shí)，才有可能使用此法。到目前為止，大部分酶都無法用直接法測定。

科學(xué)家還曾設(shè)法在原來反應(yīng)體系中添加一些試劑，這些試劑必須不與酶作用也不影響酶活性，同時(shí)又能與酶反應(yīng)物迅速作用，產(chǎn)生可以被直接測定的物質(zhì)，典型的例子是Ellman的膽堿酯酶測定法，底物為硫代乙酰膽堿，酶水解產(chǎn)物硫代膽堿與添加的二硫代硝基苯甲酸（DTNB）作用立刻生成黃色化合物，可在412nm用分光光度法連續(xù)監(jiān)測。

實(shí)際工作中，更多的是在反應(yīng)體系中加入另一酶試劑。進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿复俜磻?yīng)，完全可以勝任上述工作。目前酶偶聯(lián)法已經(jīng)成為應(yīng)用最廣、最頻繁測酶活性濃度的方法。

最簡單的酶偶聯(lián)反應(yīng)為以下模式：

Ex為所要測定的酶，A、B二物質(zhì)分別為其底物和產(chǎn)物，對(duì)此二物質(zhì)變化，無法直接監(jiān)測，此時(shí)可加入其它酶，其底物為Ex的產(chǎn)物B，其反應(yīng)產(chǎn)物C可直接監(jiān)測，這樣通過第二個(gè)酶反應(yīng)有可能推測出第一個(gè)酶的活性濃度，外加的第二個(gè)酶稱之為指示酶Ei。

如果一些酶反應(yīng)找不到合適的指示酶與其直接偶聯(lián)，此時(shí)往往可以加入另一種酶，將二者連接起來，模式如下：

將這種聯(lián)接的酶稱之為輔助酶（Ea）。個(gè)別情況可能使用二種乃至二種以上的輔助酶。

酶偶聯(lián)反應(yīng)與一般酶反應(yīng)的一個(gè)重要區(qū)別處在于其有一個(gè)明顯的延滯期。酶偶聯(lián)反應(yīng)一開始只存在著底物A，不存在指示酶的反應(yīng)，隨著產(chǎn)物B的出現(xiàn)和增加，指示酶反應(yīng)隨之加快，Ex和Ei反應(yīng)速度相等，也就是達(dá)到穩(wěn)態(tài)。從酶反應(yīng)開始至穩(wěn)態(tài)期間，指示酶反應(yīng)較慢且不穩(wěn)定，稱為延滯期。顯然這期間指示酶反應(yīng)速度不能代表測定酶量多少。設(shè)計(jì)或選擇酶測定方法時(shí)，如果用酶偶聯(lián)法，延滯期越短越好，測定時(shí)間一定要避開此期。

是不是所有類型的酶偶聯(lián)反應(yīng)都可用來測酶活性濃度？回答是否定的。因?yàn)闇y酶的活性濃度是依據(jù)測定酶反應(yīng)速度——△A/△t或△B/△t求出。在酶偶聯(lián)法，此值無法直接求出，而是通過測定指示酶反應(yīng)△C/△t間接求出，要使酶偶聯(lián)法測得的酶活性濃度準(zhǔn)確可靠，則Vind＝Vx。換言之，指示酶的最大反應(yīng)速度必須等于或接近測定酶的最大反應(yīng)速度。

當(dāng)測定酶的反應(yīng)速度明顯大于指示酶，此時(shí)A很快轉(zhuǎn)變?yōu)锽，由于指示酶反應(yīng)慢，中間產(chǎn)物B大量推積，最終產(chǎn)物產(chǎn)生速度明顯慢于底物A的消失速度。

當(dāng)指示酶速度加大后，中間產(chǎn)物B堆積減小，指示酶反應(yīng)速率偏差程度也變小。只有當(dāng)指示酶大量存在時(shí)，出現(xiàn)產(chǎn)物B就能將其迅速變?yōu)镃。

可以看出在延滯期后（即B達(dá)到高峰后的時(shí)期），C和A的變化速度非常一致。也就是只有在些情況下，才是測定酶濃度的理想條件。

從理論上說，用酶偶聯(lián)反應(yīng)測酶活性濃度時(shí)，最好條件應(yīng)是測定酶反應(yīng)為限速反應(yīng)。動(dòng)力學(xué)上為零級(jí)反應(yīng)，而指示酶為一級(jí)反應(yīng)，酶反應(yīng)速度與指示酶底物濃度相關(guān)。

（二）指示酶、輔助酶的種類和濃度

指示酶、輔助酶的種類：常規(guī)化驗(yàn)中常用的酶偶聯(lián)法中，多以脫氫酶為指示酶，在常規(guī)化驗(yàn)中的自動(dòng)分析儀幾乎無一例外都有340nm波長，通過NAD(P)H系統(tǒng)可以很方便地監(jiān)測到指示酶反應(yīng)。但從理論上說，往往可以有不止一種偶聯(lián)方法，只要設(shè)法使偶聯(lián)反應(yīng)中最后一個(gè)是指示酶反應(yīng)，前面已提到測CK可以正向逆向二個(gè)方向建立二種不同酶偶聯(lián)的反應(yīng)。又如在丙氨酸轉(zhuǎn)氨基酶（ALT）測定法中，正向反應(yīng)后產(chǎn)生丙酮酸和谷氨酶，目前最常用的是用乳酸脫氫酶與丙酮酸偶聯(lián)反應(yīng)，伴有NADH下降。但也可以用谷氨酸脫氫酶與谷氨酸作用，伴有NADH生成。

總之，酶偶聯(lián)法為實(shí)驗(yàn)室工作者開辟了一個(gè)廣闊前景。在設(shè)計(jì)和選擇測定酶活性濃度方法時(shí)，應(yīng)該創(chuàng)造更新的方法，而不應(yīng)拘泥于書本上的方法。

在選擇時(shí)首先應(yīng)考慮方法的特異性。在ALT方法，測定丙酮酸顯然優(yōu)于測谷氨酸，因?yàn)槎喾N氨基轉(zhuǎn)移酶都能產(chǎn)生谷氨酸，而只有ALT產(chǎn)生丙酮酸。還有干擾反應(yīng)或副反應(yīng)，在ALT測定中，由于正常以及病理血清中含有一定量丙酮酸，將受到它的干擾，又由于底物中含有大量α-酮戊二酸，可被血中谷氨酸脫氫酶作用消耗NADH。

其次應(yīng)考慮酶偶聯(lián)反應(yīng)的合理性，如能直接與指示酶偶聯(lián)，就沒有必要加入輔助酶，所選用的指示酶、輔助酶除了應(yīng)選Km小的酶（這樣容易使它們催化反應(yīng)速度大大超過測定酶反應(yīng)速度），還必須考慮指示酶、輔助酶是在測定酶的“最適條件”下工作，此時(shí)往往不是指示酶、輔助酶的最適條件，如二者差異太大不利于整個(gè)酶系統(tǒng)的反應(yīng)，例如乳酸脫氫酶最適pH為7.4，而丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶最適pH也是7.4，乳酸脫氫酶作為指示酶比谷氨酸脫氫酶更為合適，因后者最適pH為8.4。

如最后制成試劑盒，則還需從經(jīng)濟(jì)角度選擇一些價(jià)廉物美，又易取材、純化得到的酶制劑。

（三）指示酶、輔助酶的濃度

從上節(jié)描述中可以知道建立一個(gè)合適的酶偶聯(lián)反應(yīng)體系，不是很容易的指示酶，輔助酶的反應(yīng)要能準(zhǔn)確反映出測定酶含量，中間產(chǎn)物必須低，延滯期必須短，要作到此點(diǎn)，這些工具酶用量很大，但用量過大經(jīng)濟(jì)上不合算，所以在酶偶聯(lián)測定法中，選用適當(dāng)量的指示酶是一個(gè)重要的問題。一般可用反復(fù)試驗(yàn)法，即試驗(yàn)性地選用不同量的指示酸直到偶聯(lián)酶反應(yīng)中指示酶反應(yīng)速度不隨工具酶的增加而升高，并在所選用的“最適條件”下，指示酶反應(yīng)速度和酶活性濃度成正比例。

這種方法工作量大，而且不一定能得到最適結(jié)果，較好的辦法是可先從理論上進(jìn)行計(jì)算，得出一個(gè)大約結(jié)果，然后在此范圍內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以節(jié)約時(shí)間和精力。

最簡單的方法是根據(jù)Vx/(Km)x＝Vi/(Km)i的比值來選擇指示酶的用量Vi，式中Vx為測定酶的測定上限，(Km)x和(Km)i分別是測定酶和指示酶的米氏常數(shù)；有人計(jì)算過當(dāng)比值為1:100時(shí)，測定值低4％；如改為1:10時(shí)，指示酶的反應(yīng)速度將比測定酶反應(yīng)速度慢28％，如增加到1:1000，則誤差只有0.7％。

這是因?yàn)?，?dāng)我們用酶偶聯(lián)反應(yīng)體系測酶活性濃度時(shí)，測定酶的反應(yīng)必須是體系中的限速反應(yīng)，工具酶所催化的最大反應(yīng)速度必須遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于測定酶，由于工具酶所催化的反應(yīng)必須在中間產(chǎn)物濃度很低條件下進(jìn)行，并且將其很快轉(zhuǎn)變?yōu)樽罱K產(chǎn)物，反應(yīng)體系中不應(yīng)有中間產(chǎn)物堆積，否則將導(dǎo)致誤差。

下面舉一實(shí)例，在肌酸激酶測定法中，CK的Km為2.4mmol/L，指示酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶的Km為0.27mmol/L，如我們將CK測定上限定為450μ/L（實(shí)際測定時(shí)標(biāo)本稀釋60倍，實(shí)際為7.5μ/L），如希望上述比例為1:100。代入上式：

Vi＝3.1×10－3×min－1×0.27mmol×1

＝0.835×10－3×mmol×min－1

＝0.835U

如反應(yīng)體系為1ml，求出在此反應(yīng)體系中只需0.835U的6-磷酸葡萄糖脫氫酶即可。

另一法可以根據(jù)米氏方程式來計(jì)算，在酶偶聯(lián)反應(yīng)中，指示酶催化速度（Vi）的米氏方程式為：

以天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）為例希望中間產(chǎn)物P濃度很低，定為0.001mmol/L，指示酶蘋果酸脫氫酶。Km為0.0165mmol/L，如設(shè)定AST上限為300U/L（標(biāo)本為1:12稀釋，實(shí)測上限為25U/L）。代入上式：

Vi＝0.0014mmol min－1＝1.4U

得1.4U，如反應(yīng)體系為3ml，則試劑中蘋果酸脫氫酶用量為466U/L，目前試劑中用量為600U/L。從以上計(jì)算來看，試劑中用量是足夠的。

在酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中，不可避免會(huì)出現(xiàn)延滯期，在測定酶時(shí)希望此延滯期愈短愈好，此時(shí)可利用Mcclure介紹的計(jì)算法計(jì)算出一定延滯期時(shí)所需指示酶的量。

Mcclure假定在下面酶偶聯(lián)反應(yīng)中：

第一個(gè)反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)，第二個(gè)反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)，且中間產(chǎn)物B濃度遠(yuǎn)小于指示酶的Km，即B