乙肝致病機(jī)理及治療藥物研究再受關(guān)注

“第九屆海內(nèi)外生命科學(xué)論壇”在京隆重召開，與會(huì)專家強(qiáng)調(diào)：加強(qiáng)重要病毒性傳染病基礎(chǔ)研究刻不容緩。

乙肝病毒（HBV）在各種傳染病中發(fā)病率居第2位，死亡率居第3位，乙肝已成為世界范圍嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院李蘭娟院士、武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院吳建國教授、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所王升啟研究員在論壇上，分別圍繞應(yīng)用SELDI-TOFMS（表面增強(qiáng)激光解吸離子化飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜）研究乙肝血清蛋白質(zhì)指紋圖譜的特點(diǎn)、探究乙肝病毒X蛋白（HBx）的致病機(jī)理和進(jìn)行抗HBV藥物的篩選報(bào)告了相關(guān)工作進(jìn)展,使乙肝的防治研究再次成為研討的焦點(diǎn)。

研究乙肝血清蛋白指紋圖譜特點(diǎn)

蛋白質(zhì)組學(xué)及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，為研究重型肝炎及其并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制、病理生理及生物標(biāo)志物提供了新手段。SELDI-TOFMS是蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)的新技術(shù)，是蛋白質(zhì)芯片技術(shù)與飛行時(shí)間質(zhì)譜儀相結(jié)合的新平臺(tái)，應(yīng)用于傳染性疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷和防治等方面已取得了令人矚目的成果。李蘭娟院士領(lǐng)導(dǎo)研究小組通過該技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行了乙肝患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜特點(diǎn)的研究。

肝臟是蛋白質(zhì)合成和分解的重要器官，當(dāng)肝臟因病毒感染發(fā)生炎癥時(shí)，會(huì)引起患者體內(nèi)血清蛋白質(zhì)水平的變化。李蘭娟院士等應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測了健康對照組和慢性乙肝患者血清中相對分子質(zhì)量位于1000～10000之間的蛋白質(zhì)指紋圖譜，篩選兩組圖譜的44差異峰，應(yīng)用因子分析方法處理這44個(gè)差異峰以及6個(gè)反應(yīng)肝功能的經(jīng)典指標(biāo)（總膽紅素、直接膽紅素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、凝血酶原時(shí)間轉(zhuǎn)移酶及MELD分?jǐn)?shù)），結(jié)果提示這些差異峰是膽紅素微聚體及其類似物、凝血過程產(chǎn)生的片段以及其他分子。

隨后，他們將其中的重型肝炎血清按預(yù)后不同分成死亡組與存活組，比較兩組間的蛋白質(zhì)指紋圖譜。t檢驗(yàn)結(jié)果提示，38個(gè)峰的強(qiáng)度在兩組間存在顯著差異。用主成分分析（PCA）方法處理數(shù)據(jù)，結(jié)果提示兩組之間僅極少數(shù)樣本重疊在一起。他們采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類方法建立了重型肝炎預(yù)后預(yù)測模型，預(yù)測正確率達(dá)到85.7%；隨后依據(jù)構(gòu)建完成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，計(jì)算各差異峰相關(guān)連接權(quán)重占總權(quán)重的百分比，從而進(jìn)一步判斷各差異峰對預(yù)后的相對重要性，最終確定了5個(gè)權(quán)重最大、在預(yù)后模型中起最重要作用的蛋白質(zhì)。

李蘭娟院士表示，下一步的工作則是擴(kuò)大樣本量，不斷驗(yàn)證和優(yōu)化本研究的預(yù)測模型，同時(shí)更深入地研究這些與預(yù)后密切相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物。

探索HBx致病致癌的機(jī)理

吳建國教授指出，當(dāng)前，HBV感染機(jī)制仍無定論，致細(xì)胞病變機(jī)理也尚不清楚。而探索乙肝病毒與細(xì)胞因子的相互作用及其功能研究是揭示HBV致病和致癌分子機(jī)理的基礎(chǔ)，可為乙肝及相關(guān)疾病的防治提供依據(jù)。

他們的研究小組發(fā)現(xiàn)，HBx在肝癌細(xì)胞以及其他癌細(xì)胞系（Hela）中具有抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的功能，而以鼠胚成纖維細(xì)胞（STO）為代表的正常細(xì)胞卻具有促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的功能。研究還發(fā)現(xiàn)，用病毒基因HBx和腫瘤基因Ras共轉(zhuǎn)染STO細(xì)胞能刺激細(xì)胞凋亡，而兩者分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)卻無此功能。HBx或Ras能誘導(dǎo)裸鼠的腫瘤生長，但是HBx與Ras協(xié)同作用后卻抑制腫瘤生長。通過進(jìn)一步研究，他們提出了HBx作用的分子機(jī)制，即HBx作為腫瘤誘發(fā)因子，能刺激正常肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，與激活的原癌基因Ras協(xié)同作用后，通過誘導(dǎo)FasL蛋白的表達(dá)，激活caspase-8，降低線粒體的跨膜電位差，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤生長。

此外，他們在研究HBV與炎癥反應(yīng)的相關(guān)性及其作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，HBV能激活炎癥因子COX-2的表達(dá)，說明HBV引起的炎癥反應(yīng)可能與COX-2的激活和表達(dá)相關(guān)。研究還證明，參與調(diào)控COX-2表達(dá)的病毒蛋白是HBx，HBx通過與轉(zhuǎn)錄因子C/EBP-β直接結(jié)合，來調(diào)控C/EBP-β與炎癥因子COX-2基因啟動(dòng)子結(jié)合并激活COX-2基因的表達(dá)，從而引起細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

吳建國教授還透露，他們最近分離和鑒定了一種新的與HBx蛋白相互作用的細(xì)胞因子并將其命名為岳飛（YueF）。研究證實(shí)，YueF是一種新的腫瘤抑制因子，這為病毒學(xué)和腫瘤學(xué)等領(lǐng)域提供了新的重要信息。

篩選抗HBV藥物的“宿主靶標(biāo)”

HBV感染目前沒有特效的防治方法，其主要問題是耐藥，從而限制了靶向病毒的抗病毒藥物的發(fā)展。病毒復(fù)制具有宿主依賴性，從宿主細(xì)胞中尋找抗病毒藥物靶點(diǎn)由此成為抗病毒治療的一個(gè)新策略。王升啟研究員等的研究表明，F(xiàn)n、A-SGPR、EREG、ABHD2可能成為治療HBV感染的潛在“宿主靶標(biāo)”；以其為靶點(diǎn)的反義寡核苷酸Fn1、AS2、E3、AB3以及小分子化合物0412有可能成為治療HBV感染的先導(dǎo)化合物。這一結(jié)果為新型抗病毒藥物的篩選奠定了基礎(chǔ)。

王升啟研究員具體介紹說，他們主要取得了三方面的進(jìn)展：首先，他們篩選獲得了30個(gè)在HepG2.2.15細(xì)胞中上調(diào)而在藥物干預(yù)后表達(dá)發(fā)生下調(diào)的基因。在這30個(gè)基因中，F(xiàn)ibronectin、ASGPR1、Aromatise、SPR1、ABHD2等在HepG2.2.15細(xì)胞中特異性表達(dá)，而在藥物干預(yù)后表達(dá)顯著下調(diào)。生物信息學(xué)功能分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ibronectin、ASGPR1、ABHD2、EREG等可能成為新的HBV感染關(guān)鍵分子及潛在的抗HBV藥物作用靶點(diǎn)。

其次是發(fā)現(xiàn)HBxAg可與HSP60、HSP70形成復(fù)合物；HBxAg與MIF蛋白具有相互作用，這種相互作用在HBV致肝細(xì)胞癌中發(fā)揮重要作用。

此外，他們發(fā)現(xiàn)，在以上HBV感染相關(guān)分子中，抑制Fibronectin、ASGPR1、ABHD2、EREG的表達(dá)可抑制HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液中HBVDNA、HBsAg和HBeAg的水平，而不影響HepG2.2.15細(xì)胞的增殖，因此有可能成為抗HBV的潛在作用靶點(diǎn)。配基、小分子化合物等對Fn的進(jìn)一步驗(yàn)證顯示，F(xiàn)n有可能成為治療HBV感染的潛在作用靶點(diǎn)。對靶向Fn、ASGPR1、ABHD2、EREG的反義寡核苷酸FN1、AS2、AB3以及E3進(jìn)一步設(shè)計(jì)其正義序列、隨機(jī)序列，以其為對照進(jìn)行研究，結(jié)果顯示：這4條反義序列均特異且劑量依賴性地抑制HepG2.2.15細(xì)胞中相應(yīng)mRNA、蛋白的表達(dá)以及HBV的復(fù)制，提示其可能成為治療HBV感染的新型先導(dǎo)結(jié)構(gòu)。研究還發(fā)現(xiàn)，能抑制Fn表達(dá)的0412可在細(xì)胞模型以及鴨乙肝模型上抑制HBV的復(fù)制，這提示其可能成為治療HBV感染的新型先導(dǎo)結(jié)構(gòu)。