分子免疫學(xué)在中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中的應(yīng)用

中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究除少量采用形態(tài)法(包括顯微)外，一般均用現(xiàn)代理化分析方法。直到1995年版藥典，中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未有分子生物學(xué)理論和方法的應(yīng)用，這與當(dāng)今分子生物學(xué)的發(fā)展是極不相稱的，也不利于中藥自身發(fā)展及指導(dǎo)臨床。我們從1993年起提出應(yīng)當(dāng)以中藥品種分子遺傳特征進(jìn)行中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的新思路，并陸續(xù)在牡蠣、珍珠母、兩種爬行動(dòng)物及人參屬的專屬性鑒別中取得成功，多次獲得各種基金項(xiàng)目資助。本文結(jié)合我們的工作，簡單介紹分子免疫學(xué)在中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中的應(yīng)用。1　特點(diǎn)

大多數(shù)植物的初級或次級代謝產(chǎn)物，因其專屬性強(qiáng)，又可與化學(xué)對照品比較測定，常作為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或指標(biāo)性成分。但是單一化學(xué)成分所攜信息量有限，不同親緣種，亞種間常含相同成分，例如黃柏與黃連均含小檗堿。同一品種在環(huán)境因素作用下也可能含不同質(zhì)和量的化學(xué)成分。至于動(dòng)物類中藥，由于缺乏特異的次級代謝產(chǎn)物，更難以某種“化學(xué)成分”進(jìn)行專屬鑒別。分子生物學(xué)研究決定遺傳特征的信息大分子，包括DNA、RNA及蛋白質(zhì)，故可針對中藥的物種進(jìn)行鑒別和質(zhì)量評價(jià)。以分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行中藥鑒別，由于可以區(qū)別親緣關(guān)系的種、亞種甚至居群，對環(huán)境因素有較大保守性，將會(huì)對中藥的分類學(xué)、藥劑學(xué)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究產(chǎn)生極其深刻的影響。我們認(rèn)為以中藥物種遺傳特征作質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或者作理化分析的補(bǔ)充，有利于保護(hù)地道藥材，有利于臨床根據(jù)中醫(yī)理論用藥，也有利于市場防偽。由于國外容易接受藥材種屬遺傳特征的質(zhì)量觀念，反而不理解諸如小檗堿作為天然黃連質(zhì)量標(biāo)志的習(xí)慣，所以也還有利于出口準(zhǔn)入。對于動(dòng)物類中藥，甚至可能成為解決專屬鑒定的基本方法。2　現(xiàn)狀2.1　傳統(tǒng)蛋白質(zhì)分析　早在20多年前即有人提出以種屬蛋白特征進(jìn)行中藥鑒別思路，先后報(bào)道氨基酸含量、電泳、同工酶及免疫血清等，至今仍在繼續(xù)。主要問題是不規(guī)范，難以重復(fù)。鑒于部分中藥材及制劑中蛋白已有不同程度的水解，故近年發(fā)展的X衍射、核磁共振、質(zhì)譜、HP以及毛細(xì)管電泳等測定蛋白質(zhì)的新技術(shù)，均難以直接用于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。一般免疫化學(xué)法采用全價(jià)抗原分析，卻不能用于親緣接近的品種鑒別。2.2　DNA分子標(biāo)記　DNA作為遺傳信息的直接載體，不受環(huán)境因素、個(gè)體發(fā)育階段及組織部位影響。而且DNA化學(xué)穩(wěn)定性高，在一般貯存條件下不易降解，所以近年DNA分子標(biāo)記鑒別發(fā)展很快。從1994年香港中文大學(xué)首次報(bào)告隨機(jī)引物多聚酶反應(yīng)(AP-PCR或RAPD)鑒別人參和西洋參以來，鑒別的中藥已達(dá)30～40個(gè)品種，有的甚至申請了專利。但是目前DNA鑒別仍限于中藥材的分析，對于多種中藥組成的復(fù)方制劑，隨機(jī)多態(tài)分析技術(shù)不適用于混合模板。建議加快建立重要中藥材基因庫，尋找出品種高度保守的特異DNA序列，合成專屬的引物，才能真正應(yīng)用于中藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。2.3　蛋白質(zhì)分子免疫標(biāo)記　我們1993年承擔(dān)海王“金牡蠣膠囊生化免疫鑒別及含量測定研究”項(xiàng)目中，提出了一個(gè)不同于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)分析的思路。其核心是確證55KD多肽是牡蠣種屬特征蛋白(抗原)，純化并制定該蛋白質(zhì)的質(zhì)控條件，制成免疫學(xué)對照品。然后免疫動(dòng)物制備抗體作為檢測藥盒。采用不同方法可在10-3g及10-9g范圍與其他貝類鑒別。其線性、精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性及回收試驗(yàn)等方法學(xué)考察，均接近理化分析要求。實(shí)際上已用于企業(yè)內(nèi)部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其后證明用此方法可檢出健民“龍牡壯骨沖劑”中極微量的牡蠣蛋白。1995年我們確定14.6KD及10.2KD多肽分別是兩種爬行動(dòng)物各自特征蛋白后，首次測定了它們的氨基酸序列，人工合成“對照品”。1998年又從馬氏珠母貝外套膜中找到一個(gè)與珍珠層共有的抗原成分。由于分子免疫標(biāo)記方法可以確證一個(gè)免疫學(xué)對照品，用特異抗體進(jìn)行專屬鑒別及藥材與制劑含量測定，容易與現(xiàn)行中藥新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的要求接軌，技術(shù)也比較成熟簡便，可望先于DNA標(biāo)記應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。最近，我們進(jìn)一步提出了“人工合成種屬特征多肽對照品→工程抗體檢測”的中藥分子免疫學(xué)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的新模式。3　主要步驟及關(guān)鍵技術(shù)3.1免疫學(xué)對照品的設(shè)立和質(zhì)控3.1.1中藥材種屬特征蛋白的確證：能否取得含量豐富、抗原性強(qiáng)，既是藥典規(guī)定入藥的各亞種間共同蛋白，又不與其他類似品種交叉的特征多肽(抗原)，是整個(gè)質(zhì)量研究成敗的關(guān)鍵和難點(diǎn)。除經(jīng)典的電泳分析(SDS-PAGE、Native-PAGE、IEF、2D電泳、糖蛋白電泳)外，推薦“免疫吸收印跡電泳”技術(shù)。即先將藥材提取蛋白質(zhì)，免疫動(dòng)物制備全價(jià)抗血清，逐一加入待鑒別品種“吸收”血清中交叉的抗體，然后用吸收后血清作一抗進(jìn)行免疫印跡(westernblot)，未被吸收的組分極可能具特異性。再結(jié)合分子量，等電點(diǎn)及排除糖蛋白、脂蛋白后，可確定為該種屬特征蛋白(一個(gè)或幾個(gè))。3.1.2種屬特征蛋白純化及多克隆抗體制備：目的是對初步確證的蛋白質(zhì)作進(jìn)一步考察。如果僅作市場防偽或企業(yè)內(nèi)部質(zhì)控，提取的蛋白質(zhì)只要分子量明確，SDS-PAGE基本上一條帶，交叉免疫單一峰，再測定蛋白質(zhì)含量，即可作為粗對照品。以此免疫家兔，測定抗體滴度大于1/64，制備IgG酶結(jié)合物，已可滿足應(yīng)用的要求。特征蛋白純化可從SDS-PAGE直接制備，但多數(shù)情況下仍使用鹽析(分子篩)或凝膠過濾(離子交換方法)制備。3.1.3種屬特征短肽序列分析：天然純化的蛋白質(zhì)分子量仍較大，性質(zhì)不均一，其質(zhì)量受提取方法影響很大，與化學(xué)對照品技術(shù)要求距離較大。我們認(rèn)為，用于中藥新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的免疫學(xué)對照品，應(yīng)當(dāng)具有氨基酸序列清楚、抗原性專一、穩(wěn)定性強(qiáng)及便于制取供應(yīng)等條件，只有簡單線性多肽能符合這些條件。所以需對粗純特征蛋白進(jìn)行切割，直至獲得具有種屬抗原決定簇的肽?！坝邢廾盖须娪居≯E法”是較好的技術(shù)，方法是把純化或SDS-PAGE上的特征蛋白區(qū)帶置另一SDS-PAGE加樣槽，同時(shí)在槽內(nèi)加蛋白酶，電泳后水平轉(zhuǎn)印至2～3張PVDF膜，一部分作免疫印跡分析，另一張把保留抗原性的最小肽剪下測定氨基酸序列，即可獲該品種特征短肽。如1號爬行動(dòng)物的14.6KD組分，其特征短肽由19個(gè)氨基酸組成，N端5個(gè)依次為ANVDA，C端為G；而其親緣關(guān)系極近的2號爬行動(dòng)物，10.2KD組分的特征短肽由12個(gè)氨基酸組成，N端5個(gè)依次為LSDDE，C端為I。3.1.4種屬特征短肽人工合成：由于抗原決定簇表達(dá)只須一級結(jié)構(gòu)，可采用固相多肽合成法制備，簡單過凝膠柱純化及驗(yàn)證抗原性存在，即達(dá)到免疫學(xué)對照品要求。至于采用噬菌體肽庫技術(shù)確定特征短肽，簡并寡核苷酸合成小肽CDNA片段在噬菌體顆粒表面表達(dá)這一短肽，可能更快捷有效，但我們尚無這方面的經(jīng)驗(yàn)。3.2

檢測試藥——特異抗體制備　常規(guī)制備多肽抗體，可采用半抗原聯(lián)接蛋白形成完全抗原，產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體。近年來第三代抗體，即工程抗體技術(shù)已商品化。為提供標(biāo)準(zhǔn)化的抗體庫，廠家備有多個(gè)系統(tǒng)試劑盒。只須從免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞，提取mRNA與藥盒的引物作PT-PCR克隆Vh和Vk基因，經(jīng)DNA接頭連接后與噬菌體PCANTAB5重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌制備抗體進(jìn)行“吸附—洗脫—擴(kuò)增”的篩選富集，再經(jīng)轉(zhuǎn)染即可得到高親和力的抗該種屬特征短肽的單鏈抗體。隨基因工程技術(shù)普及，估計(jì)工程抗體生產(chǎn)成本還會(huì)降低。3.3專屬鑒別及含量測定方法3.3.1一般免疫化學(xué)法：采用免疫沉淀技術(shù)，適用于10-3g～10-5g范圍特征多肽的鑒別。例如免疫雙擴(kuò)散用在專屬鑒別及火箭電泳用來進(jìn)行含量測定。該方法假陽性少，質(zhì)控好。3.3.2　酶標(biāo)記免疫法：有的中藥含特征多肽量極微，如珍珠、牡蠣等，須高達(dá)10-9g以上才能檢出。通常采用酶標(biāo)免疫，甚至放大技術(shù)。斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫分析(DIBA)可以鑒別，將1～2μl中藥提取液點(diǎn)樣在NC膜上，用直接或間接酶結(jié)合抗體檢測，陽性斑點(diǎn)呈紅褐色。我們在牡蠣制劑鑒別中可達(dá)1ng。含量測定則用酶聯(lián)免疫吸收分析(ELISA)，用雙抗體夾心測定牡蠣特征蛋白，在0.05μg～0.90μg呈線性，RSD為6.6%，平均加樣回收率110%，最低檢測限5ng。近年來發(fā)展的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光及免疫PCR技術(shù)，使檢測限提高到10-12g以上，將會(huì)使分子免疫學(xué)進(jìn)行中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究更靈敏。

有關(guān)人工合成對照品與天然蛋白質(zhì)，工程抗體與天然抗體間反應(yīng)有何差別，孰優(yōu)孰劣?還有待實(shí)踐后回答。分子生物學(xué)用于中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究才剛起步，究竟哪些中藥適于理化分析，哪些適于DNA分析或適于分子免疫分析，也要實(shí)踐后總結(jié)。目前，應(yīng)當(dāng)集中力量進(jìn)行中藥免疫學(xué)對照品研究，爭取獲得藥檢部門的認(rèn)定和通過審批程序進(jìn)入中藥新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并且最終收載入藥典。

最近有學(xué)者強(qiáng)調(diào)草藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可能形成兩個(gè)分支：一支是接近化學(xué)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的對某一化學(xué)成分的定性定量分析，另一支是“全成分”的色譜圖象或指紋圖譜分析。并且明確指出后者可提供對品種辯認(rèn)的更多信息，更適應(yīng)中醫(yī)傳統(tǒng)理論的需要。本文介紹從人工合成特征多肽對照品到工程抗體檢測的模式，實(shí)際上可以歸入前者。所以，我們也在考慮中藥品種蛋白指紋電泳圖譜用于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的模式。在建立Panax屬西洋參、人參及三七蛋白鑒別電泳指紋圖時(shí)，注意到中藥材蛋白提取標(biāo)準(zhǔn)化，均經(jīng)脫脂、浸取、鹽析及凍干，在5mg/ml左右等蛋白恒定條件電泳。而且采用Native-PAGE.Tricine-PAGE,尤其是免疫印跡及交叉吸收免疫印跡電泳，輔助SDS-PAGE，以確定每一指紋區(qū)及重要區(qū)帶的特征和意義。我們比較不同來源西洋參15種，人參10種，三七4種，表明Panax屬三種藥材分為三個(gè)特征區(qū)。由28KD至58KD及其中55KD等2～3條多肽組成共有的蛋白質(zhì)指紋區(qū)，對該屬鑒別意義重大。28KD以下指紋區(qū)西洋參由4～5條幾乎等距區(qū)帶組成，這是該品種獨(dú)特的指紋圖，58KD以上指紋區(qū)對人參鑒別可能具有意義。市售真?zhèn)窝髤⑼杩赏ㄟ^蛋白電泳指紋圖區(qū)別，指紋圖的改變還與入藥部位、產(chǎn)地及質(zhì)量有關(guān)。下一步研究的關(guān)鍵是在中藥制劑(復(fù)方)中，如何把該品種的指紋識別出來，需要借助計(jì)算機(jī)進(jìn)行信息比較分析。也可以結(jié)合上文，將品種特征蛋白的免疫識別與常規(guī)電泳相結(jié)合。由于中藥蛋白指紋電泳譜屬“圖譜測定”范疇，不涉及免疫學(xué)對照品設(shè)立及藥盒審批程序，可能是分子免疫學(xué)應(yīng)用到中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中的一條捷徑；并可與特征蛋白檢測互相補(bǔ)充，走出一條新路子。