中藥新藥長毒動物血液生化測定SOP建立研究

中藥新藥研究過程中，藥品安全性評價是新藥研究開發(fā)的重要前提。而長期毒性試驗（以下簡稱長毒）又是安全性評價中的重中之重。長毒血液生化的檢測結(jié)果常常是評判肝腎等重要臟器功能是否正常的客觀而又靈敏的指標。但是，血液生化檢測結(jié)果卻受到諸多因素的影響。由于長期以來長毒動物血液生化檢測缺乏一大家認可的規(guī)范化（標準化）操作規(guī)程（SOP），各實驗室在血液生化檢測的取材、標本保存直至最后的測定上均有各自一套方法和習(xí)慣，加之實驗動物在種屬、飼養(yǎng)條件上的差異，致使各實驗室長毒血液生化指標差異甚大。

我國實驗動物血液生化值迄今尚無參考價值很強的正常值與正常范圍，嚴重影響了藥物安全性評價的客觀性與準確性。基于此，我們課題組在國家科技部科技基礎(chǔ)性工作和社會公益研究專項“長毒試驗動物血液生化測定規(guī)范化研究”項目的支持下，使用SPF級大鼠及健康Beagle犬，應(yīng)用全自動生化測定儀對影響血液生化測定的各項條件進行系統(tǒng)的考查，并在最終制定的SOP條件下，建立不同種屬、年齡、性別SPF級大鼠（SD、Wistar大鼠）及Beagle犬血液生化指標的正常值與正常范圍。從而為中藥新藥的安全性評價提供一個參考價值很強的數(shù)據(jù)評判體系。具體研究內(nèi)容如下：

影響因素的考查

1．采血方法對血液生化值的影響

大鼠長毒試驗中，采血部位多種多樣，如股動脈采血、股靜脈采血、頸外靜脈采血、眶后靜脈叢采血、摘眼球采血、斷頭及剪尾采血（后三種屬動靜脈混合血）等方法。這些部位采血其血液生化值是否存在差異，無人進行過系統(tǒng)研究，課題對動-靜脈血、前腔靜脈與后腔靜脈血及眶后靜脈與股靜脈血液生化值的比較，結(jié)果表明不同部位采血，其部分血液生化值存在明顯差異，動靜脈血清及頸外靜脈與后腔靜脈血液生化值主要在總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）上存在明顯區(qū)別，表現(xiàn)為股動脈或頸外靜脈血清中總蛋白、白蛋白明顯高于后腔靜脈血；大鼠眶靜脈與股靜脈血液生化值在多項指標上存在明顯區(qū)別。這可能與采血時眼內(nèi)液的混入有關(guān)。

2．樣品制備方法對血液生化值的影響

采用全自動生化儀對不同制備方法血液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素 （Urea）、肌酐（Cre）、葡萄糖（Glu）、總膽固醇（CHO）、總膽紅素（TBil）等生化值進行測定，以探討血液不同制備方法對其血液生化值的影響。結(jié)果表明，血液樣品制備過程中，抗凝與否，離心條件（溫度、速度）以及動物禁食時間長短，除常規(guī)離心速度（相對離心力1000～4000g）對血液生化值未見明顯影響外，其余各項條件均不同程度影響測定值。

3．血樣存放時間對生化值的影響

采用全自動生化儀對存放不同時間動物血液中ALT、AST、TP、ALB、TBIL、ALP、UREA、CRE、GLU、CHO等生化值進行測定，探討不同存放時間對所測定血液樣本生化值的影響。結(jié)果表明，相同溫度存放不同時間對部分血液生化值存在明顯影響，在溫度一定的條件下，存放時間愈長，血液生化值變化愈多或愈大。其中，存放時間對TP、ALB及CHO影響最明顯，而TBIL、ALT、AST在低溫條件下較存放4℃條件為穩(wěn)定，尤其保存時間在5天以上者。但試驗也顯示，無論是-18℃、-30℃還是-80℃存放，部分生化指標均與放置前有明顯區(qū)別。相對而言，不經(jīng)凍融，4℃保存相對較短時間（如48小時內(nèi)）更能反映血液生化的“真值”。不同溫度放置大鼠血清2天，4℃條件存放明顯優(yōu)于低溫凍存，表明短期存放（2天內(nèi)）不宜冷凍只宜冷藏。

4．存放溫度對生化值的影響

采用全自動生化儀對存放不同溫度動物血液中ALT、AST、TP、ALB、TBIL、ALP、UREA、CRE、GLU、CHO等生化值進行測定，探討不同存放溫度對所測定血液樣本生化值的影響。結(jié)果表明，不同溫度存放相同時間，血清生化值出現(xiàn)不同程度的變化。其中，存放時間對TP、ALB、ALT、CHO及TBIL影響最為明顯。

標準操作規(guī)程（SOP）制定

動物采血前12小時禁食（不禁水）。大鼠乙醚淺麻醉后于頸外靜脈、Beagle犬從前肢皮下頭副靜脈采血。每批次試驗，采血時間應(yīng)控制在2～3小時內(nèi)。采血后室溫（20～22℃）放置4～5小時（已有足量血清析出）后離心分離血清。血樣4℃條件常規(guī)離心。分離的血清不宜冷凍保存，可臨時4℃冷藏待測。Beagle犬血清宜當日測定。大鼠血清4℃冷藏時間不宜超過2天。

應(yīng)采用可靠性高的測定儀器（全自動生化測定儀及電解質(zhì)測定儀）進行血液生化測定，測定前應(yīng)采用定值質(zhì)控血清對儀器進行檢查，必要時應(yīng)先采用標準（校正血清）先定標，然后進行測定。

長毒試驗動物血液生化正常值及正常范圍的確定

在所確定的SOP條件下，分別對不同性別、不同年齡SPF級環(huán)境條件下SD大鼠、Wistar大鼠及健康Beagle犬（I級）血液生化指標ALT、AST、ALP、TP、ALB、Urea、Cre、Glu、CHO、Tbil、甘油三酯（TG）、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶（γ-GT）、肌酸激酶（CK）和鉀（K）、鈉（Na）、氯（Cl）等共計16項進行了測定。并根據(jù)嚴格的統(tǒng)計學(xué)分析與計算，求出長毒試驗動物正常參考值范圍。該參考值將為中藥新藥安全性評價提供一個參考價值很強的數(shù)據(jù)評判體系。