《實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸》 （一）噬菌體λ載體的構(gòu)建

野生型噬菌體λDNA全長(zhǎng)約50kb，上有65種限制酶酶切點(diǎn)，除ApaⅠ、NaeⅠ、NarⅠ、NheⅠ、Sna BⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7種限制酶各有一個(gè)切點(diǎn)外，其余都多于2個(gè)。有些酶切點(diǎn)在λ增殖所必需的基因區(qū)域內(nèi)。因此，噬菌體λ必須經(jīng)過(guò)改造才能用作載體?，F(xiàn)在用的λ載體大都除去了某種限制酶的酶切點(diǎn)。因此，作為載體的噬菌體λ都短于野生型。

噬菌體λ載體有兩種類(lèi)型：①插入型。由于改建后的噬菌體λDNA都短于野生型，所以可插入外源DNA。只要插入的位置不影響噬菌體增殖。而且噬菌體DNA缺失越長(zhǎng)，插入片段就可越大。②置換型。噬菌體λ的基因組可分為三個(gè)區(qū)域，左側(cè)區(qū)包括使噬菌體DNA成為一個(gè)成熟的、有外殼的病毒顆粒所需的全部基因，全長(zhǎng)約20kb。右側(cè)區(qū)內(nèi)包含所有的調(diào)控因子、與DNA復(fù)制及裂解宿主菌有關(guān)的基因，這個(gè)區(qū)域約長(zhǎng)12kb。中間區(qū)域約長(zhǎng)18kb，這一段DNA可以被外源置換而不會(huì)影響噬菌體λ裂解生長(zhǎng)的能力。置換型噬菌體λ是使用最廣泛的載體。

噬菌體λ裂解生長(zhǎng)的能力同包裝在頭蛋白中的λDNA的大小有關(guān)。當(dāng)DNA的長(zhǎng)度短于野生型的78%或超過(guò)105%時(shí)，噬菌體的活性就急劇下降。因此要求λ載體DNA和外源DNA長(zhǎng)度之和在39～53kb之間。

置換型載體DNA用選定的限制酶完全酶切后，要設(shè)法除去中間片段，只留下左臂和右臂以便用外源DNA片段連接，包裝成重組噬噬體。這是因?yàn)樽蟊酆陀冶叟c中間片段間都有單鏈“粘性末端”，在連接酶作用下可以重新恢復(fù)原來(lái)的結(jié)構(gòu)，從而影響了同外源DNA的連接。區(qū)分重組噬菌體形成的噬菌斑和重新恢復(fù)的載體噬菌體形成的噬菌斑的方法是用Xgal藍(lán)色噬菌斑試驗(yàn)。有些噬菌體載體的中間片段帶有編碼β半乳糖苷酸的基因。當(dāng)這種噬菌體感染lac宿主細(xì)胞并在含有Xgal（5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷）的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，半乳糖苷酸與Xgal反應(yīng)的產(chǎn)物為不溶性的靛藍(lán)染料。因此，含有中間片段的重新恢復(fù)的噬菌體形成藍(lán)色噬菌斑；而同外源DNA連接的重組噬菌體形成的噬菌斑是無(wú)色透明的。