《實用免疫細胞與核酸》 二、光敏生物素標記核酸探針

光敏生物素有一個連接臂，一端連接生物素，另一端有芳基疊氮化合物。在可見光照射下，芳基疊氮化合物可能變成活化芳基硝基苯，很易與DNA或RNA的腺嘌呤N—7位置特異結合，大約每50個堿基結合一個生物素，所以只用于標記大于200個核苷酸的片段。光敏生物素的醋酸鹽很易溶于水，與核酸形成的共價結合很穩(wěn)定。此法有以下優(yōu)點：方法簡便易行，快速省時，不需昂貴的酶和dUTP等；只需光照，探針穩(wěn)定，-20℃可保存12個月以上。適用于DNA和RNA，抗體和酶等的標記。在原位分子雜交，斑點雜交和Southern印跡雜交中應用，其特異性和靈敏性較高，價廉易購，國內已有試劑盒供應，軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所馬立人教授等研制和生產(chǎn)的光敏生物素核酸探針和檢測試劑盒使用良好。

方法步驟：在一滅菌Eppendorf管中加待標記DNa 5μg/10μl，在暗室中加入5μg/5μl光敏生物素，充分混勻，插入冰浴中，置特制光源下10cm處照射20min。加入100mmol/l Tris –HCl pH9.0, 1.0mmol/L EDTA10μl混勻。再加入等體積仲丁醇，混勻。離心1min（10000r/min）吸去上層仲丁醇，棄去。再加入仲丁醇25μl，重復提取游離的光敏生物素。吸去上層無色仲丁醇后，加入5μl 3mol/L醋酸鈉，充分混勻，加入冷無水酒精100μl充分混勻，沉淀標記DNA，置-20℃過夜（或-70℃15min）15000r/min離心20min，沉淀物再用70%乙醇洗一次，離心，抽干，溶于0.1mmol/l EDTA或TE中，測定探針濃度，分裝，保存于-20℃。