《實用免疫細胞與核酸》 四、HRP標記凝集素及凝集素抗體的制備

1．HRP標記凝集素法適用于小量的凝集素標記（Ponder 1983）。

（1）HRP的活化

①將10mg HRP(SigmaType VI)溶解在1ml 0.3mol/L 的重碳酸鈉溶液中（1.25g/50ml）。

②加50μl含1%氟二硝基苯的無水乙醇溶液，室溫輕度攪拌1h。

③加1ml含0.06mol/L的過碘酸鈉的蒸餾水（0.62g/50ml），室溫下輕度攪拌30min。

④在室溫下加兩滴0.16mol/L乙二醇，輕攪1h。

⑤用Sephadex G—25裝成小柱，用0.3mol/L的重碳酸鈉溶液，使含HRP的混合液過柱。

（2）結合

①正常條件下，可用凝集素及過氧化物酶各半量，但其比例可根據需要調整，以10mg凝集素溶解在25ml的重碳酸鹽緩沖液里，加到“活化”的HRP中去 ，這樣得出的凝集素濃度大約是0.3mg/ml，可加進0.1mol/L相應的特異的糖，以保護凝集素結合時的結合部位。糖在下步透析或層析時去掉。

②在室溫下輕攪拌，結合3h。

③加入1mg硼氫化鈉，室溫下作用1h以穩(wěn)定結合物活性。

④用1N HCl調整pH至6.4，留置室溫下過夜。

（3）純化

①用適當的凝膠層析柱如SephadexG—200、Saphacryl—300層析法將游離的凝集素、游離的過氧化物酶和高分子量的成分從結合物分離出去，包括抑制性的糖也在此時分離出去。

②提純后的結合物在280nm和403nm波長處測量其吸光率。用1%BSA先通過0.22μm的微孔過濾器，以確定被結合的凝集素是否被吸附在濾器中，然后上述結合物經過該微孔濾過器過濾到一個無菌瓶中。

③加入疊氮鈉，濃度1：1000，保存于4℃C備用。

2．抗凝集素抗體的制備抗凝集素抗體的制備法與一般免疫血清制備大致相同（見第二章?。Ｋ煌氖牵孩倌鼐哂休^強的毒性，易使被免疫動物發(fā)病或甚至死亡。解決的方法是經處理使凝集素變性，從而減低其毒性，但同時要保證其抗原性不受或少受破壞。②要設法阻斷凝集素的糖結合部位，以減少對這些部位的抗體的產生，解決的辦法是預先以相應的糖阻斷這些結合部位。Leathem 和Atkin（1982）設計了一個辦法，他們首先應用瓊脂糖（Sepharose）珠，珠上有一系列共價糖的附著，這些糖可阻斷凝集素結合部位，這種糖珠有商品供應（Sigma LtD），每1ml糖珠能結合大約12mg凝集素。其次用加入福爾馬林和加熱的方法使凝集素變性，毒性減低而不影響抗原性。具體操作如下：

①1ml瓊脂糖—半乳糖珠與1mg花生凝集素相結合，室溫1h。

②加入10ml 10%福爾馬林，在水浴中加熱到60℃，1h。

③用鹽水離心洗珠，將珠分成以10μl為單位的若干小份，保存在-20℃。

④皮下多處注射兩只家兔背部，每次注射100μl，每隔三周注射一次。取血40～50ml，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>