《實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸》 （三）酶標(biāo)抗體的純化

上述各種方法制備酶標(biāo)抗體時(shí)，除產(chǎn)生酶標(biāo)抗體外，還有未標(biāo)記的抗體蛋白、游離酶、酶二聚體及偶聯(lián)劑等。這些均可使酶標(biāo)抗體的敏感性下降，故酶標(biāo)抗體須經(jīng)純化后應(yīng)用?，F(xiàn)簡(jiǎn)介幾種常用的純化方法。

1．多聚體的分離實(shí)驗(yàn)中，不同的試劑形成的多聚體的數(shù)量各異，即使同樣的實(shí)驗(yàn)藥物和程序，在不同的時(shí)間制備的酶標(biāo)抗體中，多聚體的數(shù)量亦不相同。多聚體較單體含酶量多，與組織的非特異吸附增強(qiáng)，使方法的敏感性下降，故用前必須除去多聚體。以凝膠過(guò)濾法分離多聚體的效果較好。

2．非標(biāo)記抗體的分離 非標(biāo)記抗體與標(biāo)記抗體具有相同的免疫學(xué)特征，能競(jìng)爭(zhēng)與組織特異抗原結(jié)合，而且親和力較標(biāo)記抗體強(qiáng)，優(yōu)先與組織抗原結(jié)合。一般認(rèn)為每個(gè)抗體連結(jié)1～2個(gè)酶分子，并不影響抗體的兩個(gè)（Fab）抗原結(jié)合點(diǎn)，但因存在空間遮蔽現(xiàn)象，一個(gè)Fab段與組織特異性抗原結(jié)合。非標(biāo)記抗體則不存在這種現(xiàn)象，兩個(gè)Fab段均與抗原結(jié)合，因而親合力較強(qiáng)。所以酶標(biāo)抗體在應(yīng)用前須用瓊脂糖親合層析等方法去除非標(biāo)記抗體。

3．親合層析 　利用蛋白A（Protein A）/瓊脂糖-刀豆素A/瓊脂糖親合層析柱能制得較純的酶標(biāo)抗體。因?yàn)榈鞍譇與抗體（標(biāo)記和未標(biāo)記）間有較強(qiáng)的親合力，不與HRP結(jié)合。而刀豆素A與HRP（標(biāo)記和游離）間的親合力非常強(qiáng)，不與抗體結(jié)合。據(jù)此二者并用，能獲得較純的HRP酶標(biāo)抗體。該方法省時(shí)，分離能力強(qiáng)（約為凝膠層析的600倍）。但有一定的局限性，因?yàn)榈鞍譇并非與所有種屬的免疫球蛋白親合力均較強(qiáng)，例：不能與羊的免疫球蛋白結(jié)合，所以難以用于純化羊的酶標(biāo)抗體。而刀豆素A與HRP的親合力極強(qiáng)，甚至呈不可逆性結(jié)合，可使部分酶標(biāo)抗體的活性喪失。